[发明专利]谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及现代酶工程技术领域，具体涉及谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体及其应用。

背景技术

海藻糖，更确切地说是α，α-1，1-海藻糖是由两分子葡萄糖以α，α-1，1-糖苷键相连而成。海藻糖是一种天然性二糖，广泛地存在于微生物、虾类、酿酒酵母、蘑菇及各种真菌、昆虫、植物等。但含量甚微。过去主要是从干酵母中提取。由于含量低，提取过程较复杂，成本极高。如此昂贵的海藻糖只能局限于某些特殊领域如医学生物制品的活性保持的应用。随着人类社会的发展和进步，要求将海藻糖应用于各类食品的鲜味保持与质地改善的趋势越来越明显，因此必须要尽快地找到廉价而高效的海藻糖制造方法。目前研究发现生物存在多种酶系能够合成海藻糖，海藻糖合成酶就是其中之一，它能够转化麦芽糖生成海藻糖，而麦芽糖可以通过水解淀粉制备，因而是一种具有工业应用前景生产海藻糖的酶。

发明内容

本发明的目的在提供谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶突变体及其应用。该突变体能够提高适反应温度和耐热性，其酶学特性更加适合用于工业化生产海藻糖，有利于降低海藻糖的生产成本。

本发明通过以下技术方案达到上述目的，

一种谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，该突变体含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

一种谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，该突变体含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

一种谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，该突变体含有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

一种谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，该突变体含有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

所述谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，其获得方法是对具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列至少有80％同源性的海藻糖合成酶的氨基酸序列中至少一个氨基酸残基进行置换，这些氨基酸对应第263位氨基酸残基。

所述氨基酸残基置换是用第263位的F氨基酸残基置换成其它19种氨基酸残基。

所述任何一项谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体的相关基因，或者还有该基因的载体。

所述任何一项谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变体，其中的突变体酶F263C、F263Y、F263L和F263W比亲本野生型的海藻糖具有更低的反应pH和更高的反应温度，其中F263C和F263Y反应pH为7.5，F263L和F263W反应pH为6.5，F263W的反应温度为32℃。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶突变体，是采用定点突变技术以谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶为基础，对其氨基酸序列的F263的氨基酸残基进行饱和突变成其它其它的19个氨基酸，将突变得到海藻糖合成酶的基因进行表达得到新的海藻糖合成酶。

本发明突出的实质性特点和技术效果在于：

突变后海藻糖合成酶基因表达的海藻糖合成酶的反应动力学发生改变，如酶的比活、最适反应温度和最适pH值等酶学特性发生了改变，突变酶的热稳定性均有不同程度的提高，其中F263Y和F263W的Tm值为47℃比野生型的提高约1℃；突变酶F263L为48℃比野生型的提高约2℃，而突变酶F263C热稳定性提高了近4℃。

这种酶能够提高海藻糖合成酶的转化效率，可以进一步降低海藻糖的生产成本。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作详细描述：

本发明所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶是在本发明人研究谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶的基础上，利用定点突变技术对中国专利204410013006.9公布的谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法所述的海藻糖合成酶进行定点突变得到，谷氨酸棒杆菌菌种可以从工业微生物保藏中心购买，也可以通过野外采集和其他途径获得。本发明采用的微生物培养、基因克隆和表达技术和相关的技术方案是本领域中常用的成熟技术，本发明的涉及的专业术语也是本领域中常见的专业术语，因此对于本领域的专业员来说本发明的文本对于本领域的专业人员来说是显而易见的。

实施例1

1、海藻糖合成酶基因的定点饱和突变