[发明专利]人工改造合成的抗草甘膦基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种人工改造合成的抗草甘膦基因以及其构建的植物表达载体及其在抗除草剂转基因植物研制方面的应用。 

背景技术

草甘膦是一种非选择性除草剂，具有理化性质稳定、高效、广谱、低毒、低残留、易于被微生物分解，不破坏土壤环境等优点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的农药品种。自从1976年美国孟山都公司的草甘膦类除草剂-农达(Roundup)研制成功并得到广泛应用以来，作物抗草甘膦转基因研究成为抗除草剂基因工程研究的热点。随着抗草甘膦基因克隆的发展，抗草甘膦转基因作物也相继问世并大面积推广应用，这些转基因作物具有如下优点：(1)减少除草剂总用量，使杂草防治费用下降，增加农产品的经济效益；(2)所用除草剂品种广谱、选择性强、对环境友好、使用方便，特别适用于保水，减轻土壤侵蚀及石油耗量少的少耕与免耕体系，减少机械耕作作业，大大节省能源；(3)解决了常规除草剂难以防治的特殊杂草问题，如稻田的野生稻、赤稻、宽叶臂形草、圆叶牵牛、大果田菁；小麦田的雀麦(Bromus spp)、莎草(Cyperus spp)；大豆田的鸭趾草、蓟、苣荬菜、纯叶决明以及寄生杂草。(6)解决土壤长残留性除草剂对后茬作物的伤害。转基因作物所使用的草甘膦无土壤残留，故对后茬作物十分安全。 

草甘膦的作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。该酶是真菌、细菌、藻类和高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键性的酶。草甘膦是磷酸稀醇式丙酮酸(PEP)的类似物，是EPSPS竞争性抑制剂，草甘膦、EPSPS和三磷酸莽草酸(S3P)结合形成EPSPS-S3P-草甘膦复合体(此复合体非常稳定)，抑制EPSPS的活性导致分支酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，最终导致一些激素和关键性代谢物如类黄酮、木质素和酚类化合物代谢失调，从而扰乱了生物体正常的氮代谢而使其死亡。 

将编码EPSPS的基因在植物体中过量表达、或选用对草甘膦不敏感的EPSPS(如从根癌农杆菌CP4菌株中克隆的CP4-EPSPS编码基因)、或对EPSPS的氨基酸序列进行修饰或点突变，或导入降解草甘膦的基因(如编码草甘膦氧化还原酶的gox基因)、或导入氮乙酰转移酶(GAT基因)使草甘磷乙酰化等，可使植物获得对草甘膦的抗性。目前国际上除抗草甘膦的大豆、玉米、油菜、棉花和苜蓿已商业化外，抗草甘膦的转基因小麦、甜菜和匍匐剪股颖(Creeping bentgrass，牧草)也已获得。我国抗草甘膦转基因作物的研发相对滞后，赵福永等(2005)、王景雪等(2005)曾将aroAM12基因转入棉花和油菜，分别获得了抗草甘膦的转基因棉花和油菜，迄今国内尚未见具有自主知识产权的抗草甘膦作物成功商业化的报道。中国发明专利CN200610052573.4公开了一种来源于假单胞杆菌(Pseudomonas sp G3)的抗草甘膦基因(EPSPS基因)，但由于其来源于细菌，细菌密码子偏好性与植物有较大差异，将来自细菌的EPSPS基因直接转化植物，其表达效率较低。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种在植物中能高效表达的抗草甘膦基因，可以提高转基因植物的抗除草剂能力。 

为解决上述技术问题而提供的一种人工改造合成的抗草甘膦基因，其是根据一种来源于细菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因，利用植物密码子偏好性进行设计改造后用人工合成的方法而获得的，设计过程中去除了多聚腺苷酸加尾信号、切割加工序列、植物稀有密码子、非预期产生的限制性内切酶识别位点，并设计了便于进一步实施利用的限制性内切酶切位点结构，该基因命名为BHR2，具有SEQ ID NO：1中3-1325所示的核苷酸序列。 

在上述人工改造合成的抗草甘膦基因核苷酸序列5’端融合了一段编码叶绿体导肽的核苷酸序列。 

融合棉花来源编码叶绿体导肽(PTP)核苷酸序列的抗草甘膦融合基因，命名为PTP-BHR2，具有SEQ ID NO：2中10-1563所示的核苷酸序列。 

融合拟南芥来源编码叶绿体导肽(ATP)核苷酸序列的抗草甘膦融合基因，命名为ATP-BHR2，具有SEQ ID NO：3中10-1560所示的核苷酸序列。 

融合矮牵牛来源编码叶绿体导肽(CTP)核苷酸序列的抗草甘膦融合基因，命名为CTP-BHR2，具有SEQ ID NO：4中10-1548所示的核苷酸序列。