[发明专利]检测水泡性口炎抗体试剂盒及其制备方法

权利要求书

1、一种检测水泡性口炎病毒抗体试剂盒，其特征在于，包括分别放置的试剂I和试剂II，其中所述试剂I为水泡性口炎病毒抗原包被酶联免疫吸附试验测定板，所述试剂II为单克隆抗体IgG-HRP酶结合物，其中所述单克隆抗体IgG-HRP酶结合物为辣根过氧化酶标记的鼠抗水泡性口炎病毒的特异性单克隆抗体。

2、根据权利要求1所述的检测水泡性口炎病毒抗体试剂盒，其特征在于，还包括分别放置的阳性血清、阴性血清、20倍浓缩洗涤液、10倍浓缩洗涤液、底物I、底物II、底物III以及终止液。

3、根据权利要求2所述的检测水泡性口炎病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含0.05％Tween-20的0.01mol/L pH 7.4PBS/PBST；10倍浓缩稀释液为10倍浓缩的含1％明胶的PBST；底物I为pH6.0的乙酸-柠檬酸缓冲液；底物II为3.3’-5.5’-四甲基联苯胺溶液；底物III为双氧水溶液；终止液为1mol/L H₂SO₄硫酸溶液。

4、根据权利要求2或3所述的检测水泡性口炎病毒抗体试剂盒，其特征在于，各组成部分的体积或数量如下：

试剂盒组成部分名称：                            体积或数量：

水泡性口炎病毒抗原包被酶联免疫吸附试验测定板    2板96孔酶标板

单克隆抗体IgG-HRP酶结合物                       0.5ml

阳性血清                                        1ml

阴性血清                                        1ml

20倍浓缩洗涤液                                  50ml

10倍浓缩稀释液                                  30ml

底物I                                           20ml

底物II                                          2ml

底物III                                         1ml

终止液                                          20ml。

5、根据权利要求1-3中任一项所述的检测水泡性口炎病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述水泡性口炎病毒抗原包被酶联免疫吸附试验测定板通过以下方法制备：将纯化后的水泡性口炎病毒抗原用优化好的包被缓冲液稀释成4.0μg/mL，以50μL/孔加入酶联免疫吸附试验测定板，置4℃冰箱中过夜包被后拍干酶联免疫吸附试验测定板；然后以200μL/孔加入优化好的封闭液，置4℃冰箱中封闭过夜后彻底拍干。

6、根据权利要求5所述的检测水泡性口炎病毒抗体试剂盒，其特征在于，所述水泡性口炎病毒抗原通过以下方法制备：BHK-21细胞长成单层后接种水泡性口炎病毒并使用无血清的基础培养基培养，在细胞病变达75％以上时收获病毒，反复冻融3次后以8000转/分钟离心30分钟，取上清液，加入终浓度为1/3000的甲醛灭活病毒，采用20％、60％的不连续蔗糖密度梯度20000转/分钟4℃超速离心3小时，收获提纯的病毒条带作为抗原。

7、一种如权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：

(1)使用水泡性口炎病毒制备水泡性口炎病毒抗原；

(2)使用提纯的水泡性口炎病毒抗原免疫小鼠并取免疫小鼠的脾细胞，将所述脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂下融合后筛选获得杂交瘤细胞，将所述杂交瘤细胞注入小鼠制备抗水泡性口炎病毒单克隆抗体腹水；

(3)使用抗水泡性口炎病毒单克隆抗体腹水制备抗水泡性口炎病毒单克隆抗体辣根过氧化酶酶结合物；

(4)制备水泡性口炎病毒抗原包被酶联免疫吸附试验测定板：将纯化后的水泡性口炎病毒抗原用优化好的包被缓冲液稀释成4.0μg/mL后加入酶联免疫吸附试验测定板，置冰箱中过夜包被后拍干酶联免疫吸附试验测定板；然后在酶联免疫吸附试验测定板的孔内加入优化好的封闭液，置冰箱中封闭过夜后彻底拍干。