[发明专利]量子点组合微球标记核酸探针及其制备方法和应用

权利要求书

1.量子点组合微球标记核酸探针在制备染色体核型分析试剂中的应用，所 述量子点组合微球标记核酸探针的制备方法包括以下步骤：

a、制备24种全染色体涂抹探针并用生物素进行标记；

b、制备5种具有不同发射光谱特征的量子点，从5种具有不同发射光谱特 征的量子点中任取1至3种组成24种具有不同发射光谱特征的量子点组合；制 备高分子微球；将24种具有不同发射光谱特征的量子点组合分别装载在高分子 微球中，制得24种具有不同发射光谱特征的量子点组合微球并用链霉亲和素进 行标记；

所述5种具有不同发射光谱特征的量子点的制备方法具体如下：将氯化镉 即CdCl₂·2.5H₂O和巯基乙酸即MAA的混合溶液用浓度为1mol/L的NaOH溶 液调节pH至10.2，通氮气30分钟后，在搅拌条件下加入新制的碲氢化钠NaHTe 溶液，Cd²⁺/Te^2-/MAA的摩尔比为1∶0.5∶2.4，继续搅拌20分钟，制得橙色 的CdTe量子点前驱体溶液；将此前驱体溶液在100℃水浴中回流反应不同时间， 制得5种具有不同发射光谱特征且表面修饰有羧基的CdTe量子点溶液 QD1～QD5，最大发射波长分别为525nm、550nm、565nm、605nm和620nm； 在上述CdTe量子点溶液中分别加入适量异丙醇以降低CdTe量子点的溶解度， 再于10000r/min离心30分钟，弃上清，即得纯化的CdTe量子点；

所述高分子微球的制备方法具体如下：以苯乙烯和甲基丙烯酸为共聚合单 体，二乙烯基苯为交联剂，过硫酸钾为引发剂，用分散聚合的方法进行制备： 按一定质量比取十二烷基硫酸钠和十六醇，加水溶解，在搅拌、氮气保护条件 下加热至温度60℃，加入苯乙烯和二乙烯基苯的混合液以及甲基丙烯酸溶液， 继续搅拌45分钟后，再加入过硫酸钾溶液，升温至温度70℃引发聚合，在恒温、 氮气保护条件下反应3小时得咖啡色乳液，再经分离、洗涤、干燥后，得表面 带有羧基的亲水性高分子微球；

所述24种具有不同发射光谱特征的量子点组合微球的制备方法具体如下： 在含有体积百分浓度为5％的氯仿和体积百分浓度为95％的丙醇的溶液中，加入 高分子微球，并按下表所示加入从5种具有不同发射光谱特征的量子点中选择1 至3种且每种数量相同组成的量子点组合，搅拌均匀，使量子点组合装载在高 分子微球中，再经分离、洗涤、干燥后，即制得24种具有不同发射光谱特征的 量子点组合微球；

所述量子点组合微球的链霉亲和素标记方法具体如下：在浓度为0.1 mol/L、pH为8.5的磷酸盐缓冲液中，加入量子点组合微球0.6mg和浓度为 8.7g/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺即EDC 250μL，EDC用量为 量子点的50～100倍，混匀，再加入链霉亲和素0.12mg，室温下搅拌反应3小 时后，上Sephadex G100层析柱，用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS洗脱， 得纯化的链霉亲和素标记的量子点组合微球溶液；按照上述方法，对24种具有 不同发射光谱特征的量子点组合微球分别进行链霉亲和素标记，制得24种具有 不同发射光谱特征且链霉亲和素标记的量子点组合微球；

c、将生物素标记的全染色体涂抹探针与链霉亲和素标记的量子点组合微球 通过生物素与链霉亲和素的特异性结合进行偶联，使不同序列的全染色体涂抹 探针标记上具有不同发射光谱特征的量子点组合微球；

具体方法如下：将链霉亲和素标记的量子点组合微球先用pH为7.4的牛 血清白蛋白溶液封闭非特异性位点，再与生物素标记的全染色体涂抹探针在 pH为8.0的PBS中室温避光反应24小时，最后用层析柱分离纯化，即得量 子点组合微球标记的全染色体涂抹探针；按照上述方法，将24种具有不同发 射光谱特征且链霉亲和素标记的量子点组合微球分别与24种生物素标记的全 染色体涂抹探针通过生物素与链霉亲和素的特异性结合进行偶联，使不同序列 的全染色体涂抹探针标记上具有不同发射光谱特征的量子点组合微球，即得24 种发射不同颜色荧光的量子点组合微球标记全染色体涂抹探针。