[发明专利]量子点标记核酸探针及其制备方法和应用有效

专利信息
申请号: 200910103353.3 申请日: 2009-03-11
公开(公告)号: CN101525668A 公开(公告)日: 2009-09-09
发明(设计)人: 罗阳;王珏;府伟灵;黄君富 申请(专利权)人: 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10;G01N21/64
代理公司: 北京同恒源知识产权代理有限公司 代理人: 赵荣之
地址: 400038重*** 国省代码: 重庆;85
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摘要:
搜索关键词: 量子 标记 核酸 探针 及其 制备 方法 应用
【权利要求书】:

1.非诊断目的的应用量子点标记核酸探针进行染色体核型分析的方法,其特征在于:包括以下步骤:

a、合成24种全染色体涂抹探针并用生物素进行标记;

b、合成24种具有不同发射光谱特征的量子点并用链霉亲和素进行标记,具体如下:

将氯化镉CdCl2·2.5H2O和巯基乙酸MAA的混合溶液用浓度为1 mol/L的NaOH 溶液调节pH至10.2,通氮气30分钟后,在搅拌条件下加入新制的碲氢化钠NaHTe溶液,Cd2+/Te2-/MAA的摩尔比为1∶0.5∶2.4,继续搅拌20分钟,制得橙色的CdTe量子点前驱体溶液;将此前驱体溶液在100℃水浴中回流反应不同时间,制得24种具有不同发射光谱特征且表面修饰有羧基的CdTe量子点溶液,最大发射波长分别为440nm、450nm、460nm、475nm、490nm、510nm、520nm、530nm、540nm、550nm、560nm、575nm、580nm、590nm、605nm、610nm、620nm、630nm、640nm、650nm、660nm、670nm、680nm和690nm;在上述CdTe量子点溶液中分别加入异丙醇以降低CdTe量子点的溶解度,再于10000r/min离心30分钟,弃上清,即得纯化的CdTe量子点;

在浓度为0.1 mol/L、pH为8.5的磷酸盐缓冲液即PBS中,加入表面修饰有羧基的CdTe量子点0.6 mg和浓度为8.7g/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺即EDC 250μL,EDC用量为量子点的50~100倍,混匀,再加入链霉亲和素0.12mg,室温下搅拌反应3 小时后,上Sephadex G100层析柱,用浓度为0.1 mol/L、pH为7.4的PBS洗脱,得纯化的链霉亲和素标记的CdTe量子点溶液;按照上述方法,对24种具有不同发射光谱特征且表面修饰有羧基的CdTe量子点分别进行链霉亲和素标记,制得24种具有不同发射光谱特征且链霉亲和素标记的CdTe量子点;

c、将生物素标记的全染色体涂抹探针与链霉亲和素标记的量子点通过生物素与链霉亲和素的特异性结合进行偶联,使具有不同序列的全染色体涂抹探针标记上具有不同发射光谱特征的量子点,具体如下:

将链霉亲和素标记的CdTe量子点先用pH为7.4的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性位点,再与生物素标记的全染色体涂抹探针在pH为8.0的PBS中室温避光反应24小时,最后用层析柱分离纯化,即得CdTe量子点标记的全染色体涂抹探针;按照上述方法,将24种具有不同发射光谱特征且链霉亲和素标记的CdTe量子点与24种生物素标记的全染色体涂抹探针通过生物素与链霉亲和素的特异性结合进行偶联,使具有不同序列的全染色体涂抹探针标记上具有不同发射光谱特征的量子点,即得24种发射不同颜色荧光的量子点标记全染色体涂抹探针,置-20℃避光保存;

d、应用上述制得的量子点标记全染色体涂抹探针进行染色体核型分析,具体如下:

d1、制备中期染色体标本

取多发性骨髓瘤患者骨髓涂片,用浓度为0.4μg/mL的秋水仙胺处理1.5小时,37℃胰酶消化6分钟,加入浓度为0.075mol/L的氯化钾溶液10mL,轻轻吹打均匀,37℃水浴30分钟,加入预冷的固定液固定,所述固定液为甲醇∶冰醋酸=3∶1的混合液,再将细胞悬液滴至载玻片上,过夜干燥,即得中期染色体标本,置-20℃保存;

d2、将量子点标记核酸探针和中期染色体标本进行原位杂交,具体如下:

中期染色体标本的预杂交:取中期染色体标本,滴加浓度为100 μg/mL的RNA酶溶液,所述RNA酶溶液是将浓度为10 mg/ml的RNA酶溶液用2×SSC缓冲液稀释制得,所述2×SSC缓冲液由浓度为0.3mol/L的氯化钠和浓度为0.03mol/L的柠檬酸三钠组成,盖上盖玻片,37℃孵育30分钟,用2×SSC缓冲液漂去盖玻片并洗涤5分钟,再滴加质量百分浓度为0.05%的胃蛋白酶溶液,所述胃蛋白酶溶液是将质量百分浓度为10%的胃蛋白酶溶液用浓度为1mol/L的HCl溶液稀释制得,盖上盖玻片,37℃孵育10分钟,用2×SSC缓冲液漂去盖玻片并洗涤5分钟,再置体积百分浓度为1%的甲醛溶液中,37℃固定10分钟,用PBS洗涤5分钟,再立即依次置预冷的体积百分浓度为70%、90%、100%的乙醇系列溶液中脱水,每次5分钟,自然干燥;

量子点标记核酸探针和中期染色体标本的原位杂交:将经过预杂交处理的中期染色体标本置体积百分浓度为70%的甲酰胺溶液中变性3分钟,所述甲酰胺溶液用2×SSC缓冲液配制,再立即依次置预冷的体积百分浓度为70%、90%、100%的乙醇系列溶液中脱水,每次5分钟,自然干燥;将24种量子点标记核酸探针在75℃恒温水浴中温育5分钟,之后立即在0℃静置5~10分钟,使双链DNA探针变性;将已变性的24种量子点标记核酸探针滴加在已变性的中期染色体标本上,盖上盖玻片,用橡皮泥封片,再转移至潮湿暗盒中,控制杂交pH为6~7,37℃杂交24小时;

中期染色体标本的漂洗:杂交完毕后,取出中期染色体标本,用刀片轻轻将盖玻片揭掉,先用预热至73℃的体积百分浓度为0.3%的乙基苯基聚乙二醇即NP-40溶液洗涤2分钟,所述NP-40溶液用0.4×SSC缓冲液配制,再在室温下用体积百分浓度为0.3%的NP-40溶液洗涤1分钟,PBS洗涤2分钟,再置体积百分浓度为70%、90%、100%的乙醇系列溶液中脱水,每次5分钟,自然干燥,再用4,6-二氨基-2-苯基吲哚即DAPI复染,PBS洗涤多余的DAPI,自然干燥,置-20℃保存;

d3、对杂交信号进行荧光检测

将杂交后的中期染色体标本置安装有冷CCD摄像头的荧光显微镜下,进行多色荧光原位杂交的图像采集和数据处理,绘制24色人类全基因组染色体核型图谱。

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