[发明专利]一种无假阳性T载体及制备方法

说明书

技术领域

本发明内容属于生物技术领域，具体涉及一种T载体及制备。

背景技术

1、质粒载体

分子克隆技术是基因工程技术的基础。分子克隆技术用于将一段目的基因(DNA片段) 插入一个DNA载体中以长期保存和大量制备该目的基因供进行后续研究。最常用的分子克 隆载体是质粒载体：一个能在细菌细胞中自主复制、传代的闭合环状双链DNA分子。一个用 于分子克隆的质粒载体至少要包含如下3个功能单元：质粒自主复制必须的基因元件，1-2 个抗生素抗性基因，供插入目的DNA片段用的酶切位点。现代正筛选质粒载体还包括一个 用于正筛选阳性克隆的筛选标记基因(如利用α互补原理进行蓝白斑筛选的β半乳糖苷酶α 片段基因)。

2、T-A克隆技术和T载体

PCR技术产生以后已经成为最常用的获取目的基因的技术，最初克隆PCR片段的方法是 通过PCR引物在扩增的DNA片段两端引入与克隆载体匹配的酶切位点，然后酶切PCR产物， 通过连接酶将其插入同样酶切的克隆载体中。后来又发展出能更快捷克隆PCR片段的T-A克 隆技术。

T-A克隆技术的原理是：PCR反应中普通Taq酶能在扩增的DNA片段的3’端添加一个突 出的dA，因此如果线性化的载体的3’端具有一个突出的dT，则与PCR片段形成互补的粘性 末端，二者就能够高效连接从而获得包含目的PCR片段的重组质粒，这一技术即为T-A克隆 技术。目前常用的T载体制备方法有两种：

(1)平末端加T法：在普通克隆载体(即前T载体，如pUC18)的阳性克隆正筛选标记基 因(如pUC18中的LacZ基因)编码区内部通过平末端内切酶(如pUC18中的Sma I)将前 T载体酶切线性化，再利用Taq酶的末端转移酶活性在只有dTTP存在的条件下在线性化后的 平末端载体分子的3’端加上1个dT，制备成T载体。

(2)双位点酶切直接制备法：在阳性筛选标记基因内引入两个串联的、切开后能在线性化 载体的两个3’端突出一个dT的同一内切酶位点(如Xcm I)即构成前T载体，这种前T载 体只需用相应内切酶切开前T载体，纯化回收载体片段即可制备T载体。

T载体是T-A克隆技术的核心，现在有很多试剂生产商制造、销售商品化的T载体。与 需要酶切后再连接的传统分子克隆技术相比，T-A克隆技术极大地简化了克隆目的基因的过 程，而且方便目的基因的序列测定和通过酶切进行亚克隆(以便进行目的基因的表达)，现在 已经成为分子克隆的常规技术。

3、现有T载体的技术机制缺陷

T-A克隆技术提供了将PCR片段高效连接插入载体的捷径，但是现有T载体由于设计上 的技术机制缺陷，其应用于T-A克隆时在阳性克隆筛选环节仍然存在较大的问题，即假阳性 问题，并因此给使用者的克隆实验带来很大的困难。

现有T载体大多是利用α互补原理的蓝白斑筛选技术来筛选阳性克隆的：载体上有β半 乳糖苷酶的α片段(Lac Z)表达盒，PCR片段的插入位点就设计在α片段的编码区内部(靠 近N端)。因此当目的片段插入T载体后，α片段的读码框被打断，因而不能正确表达(插入 失活)，含有重组载体的阳性转化子在含有诱导剂IPTG和显色底物X-gal的筛选培养基上生 长的菌落为白色；反之，含非重组载体(即前T载体)的阴性转化子会由于α片段的表达在上 述筛选培养基上长成蓝色菌落。因此，利用这一正筛选技术，只需要将转化产物在筛选培养 基上培养就可通过菌落颜色筛选出阳性克隆。

然而现有T载体在实际应用时长出的白色菌落中有一部分并不含有插入片段(即所谓假 阳性克隆)。那么这些假阳性克隆是如何产生的呢？

1)平末端加T制备的T载体

这种T载体是在前T载体的阳性克隆筛选标记基因内的平末端酶切位点将其酶切线性化 后在两个3’端额外添加了一个dT，因此，如果在T-A克隆中线性化T载体分子自连(又称 误连，mis-ligation，即非互补粘性末端的连接)，其转化入宿主细胞后这个不互补的dT—dT 碱基对会经宿主细胞修复为互补的dT—dA碱基对，于是是α片段的编码区内在此处多出了 1个bp，这毫无疑问将使其后面的读码框(ORF)完全改变(称为移码，frame shift)，其后 果是α片段不能正确表达，转化入宿主细胞后不能完成α互补，与有PCR片段插入的阳性克 隆一样呈现为白色菌落，成为假阳性克隆。

2)双位点酶切直接制备的T载体：