[发明专利]一种检测桑树花叶萎缩病病原体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及病原体的鉴定及桑树及其幼苗转运中的检疫等用途， 尤其涉及桑树及其幼苗在转运中的检疫等应用，属于生物检测技术领 域。

背景技术

桑花叶型萎缩病又称“癃桑”。早在1313年古农书中就有记载(王 祯农书，元代圣庆2年)。现今在江、浙蚕农所谓的“癃桑”，实际上 具有多种症状。其中，叶部呈现黄绿相间的花叶症的一种，定名为桑 花叶型萎缩病(蒯元璋，1965)。此病仅分布在中国，在我国的浙江、 四川、安徽、江苏、江西、云南、上海、重庆等省、市蚕区均有发生。 因此，此病已成为国内重要的桑树病害。1990年在病桑组织内发现 类似类病毒(Viroid)的小分子RNA病原体(蒯元璋、田波等，1990)。 2007年，费建明等获得了该病原体的部分序列(费建明等，2007)， 并于2008年在GenBank数据库中登录了该病原体的全长序列。但目 前该病尚无有效的防治方法。因此，对该病的检疫将有助于防止该病 的进一步扩散。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测桑树花叶萎缩病病原体的方 法。一种检测桑树花叶萎缩病病原体的方法，包括以下步骤：

①从待检测的桑树的叶片或芽体剪取样品，提取总RNA得到提 取溶液；

②在所述提取溶液中加入DNA分解酶，待DNA分解后得到总RNA 溶液；

③取总RNA溶液中的溶液，将RNA进行RNA逆转录，合成cDNA；

④对合成的cDNA进行PCR扩增；

⑤取扩增的cDNA，在琼脂糖下电泳，得到提纯的cDNA；

⑥将经过步骤⑤得到的cDNA在紫外灯下观察是否有扩增的 DNA条带。

作为优选，所述的将RNA进行RNA逆转录是由腺苷酸、尿苷酸、 胸腺嘧啶和尿嘧啶随机组合的长度为6个核苷酸的随机引物的混合 物为引物。

作为优选，所述步骤④中PCR扩增时使用的引物序列为：引物 1：5’-GTC CAG ACA CAC ATC T-3’，引物2：5’-TGA TGA GTT CGA AAG AAC-3’。

作为优选，所述PCR扩增条件是先于95℃变性5分钟然后进入 30个PCR的循环，循环结束后，再在72℃条件下保持10分钟。

作为优选，步骤⑥所述紫外灯观察在356bp位置进行。

作为优选，步骤①中所述的提取总RNA是以Trizol试剂作为提 取剂提取总RNA。

在琼脂糖电泳后，如果能在紫外灯下在356bp位置看见扩增的 DNA条带，则表明该桑树或苗中携带该病原体。如果样品中存在该分 子，整枝植株应予以销毁，以防止该病的扩散。

本发明的有益效果在于可通过对该病原体特征序列的扩增来检 测病原体的存在，一般可在数小时内完成，快速灵敏。

具体实施方式

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限 制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做 出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到 专利法的保护。

实施例一

一种检测桑树花叶萎缩病病原体的方法，包括如下步骤：

①桑树叶或芽体的总RNA提取：从待检测的桑树或桑苗的叶片 或芽体剪取0.5克样品，以Trizol试剂提取总RNA。在经氯仿提取 除去多余的蛋白质后，在提取溶液中加入DNA分解酶以除去溶液中的 DNA获得总RNA。

②cDNA的合成：取经步骤①得到的总RNA 0.1～0.5mg，采用 由腺苷酸、尿苷酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶随机组合的长度为6个核苷酸 的随机引物的混合物为引物，用RNA逆转录酶进行RNA逆转录，42℃ 下保持50分钟，合成cDNA。