[发明专利]一种可溯源酶校准物质的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种用于检验医学的、具良好互换性的可溯源酶校准物质的制备方法，属于医学检验体外诊断试剂的技术领域。

背景技术：

酶活力的测定是临床检验中最频繁的测定项目，意义重要。但由于现存的临床检验体系和酶反应的特点，在实际工作中存在很多的问题。首先酶活性浓度的测定是通过间接推算法获得的；其次，影响酶浓度正确测定的因素很多；另外，临床检验中由于检测样本的取样量小，每份样本可能需做多项检验；结果需要及时报告等原因，在一定程度上牺牲了方法特异性和准确性。致使同一种酶存在多种参考范围，各个实验室检测的结果缺乏可比性，病人每到一个医院都要重新化验。重复检测浪费了大量的社会资源。

提高和保证临床检验的准确性，使不同方法、厂家、实验室的检验结果具有可比性，检测结果可以溯源，即临床检验标准化，一直是临床检验界及有关行业与部门的重要课题。

建立和保证检验结果的溯源性在国际上也已成为法律要求。例如：欧盟指令(Directive98/79/EC)/国际标准化组织ISO 17511等要求临床检验产品必须保证其结果的溯源性。参考物质需要提供给诊断试剂生产者以使其能够溯源到参考方法。必须将校准物质和质控物质定值的计量学溯源性用于室内质控以及试验系统的评价。图1为从参考物质到常规检测结果的溯源链。

显然酶参考物质的应用可以改进方法间的符合程度，使优良检测体系所测定的结果具有溯源性。现在国际的参考物质来自于各种动物或者人的组织，其下一级产品校准物质主要为国外的大公司根据本身产品特点生产，缺乏溯源性分析，不同产品的定值存在矛盾。另外，校准物质的互通性也存在问题，数据显示：室间质量评价/能力验证中用到的质控品、校准品也常有基质效应，研制互通性良好、具有溯源性的校准物质是临床检测结果准确性的必要保证。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种可以溯源至国际(国家一级)参考物质的与人各种血清标本具良好互换性的酶校准物质，用于临床检验中常规诊断试剂的校准物质的配备以及医院的日常质量控制；为完成整个溯源链的建立提供技术支撑，促进中国医学检验事业的规范发展的可溯源酶校准物质的制备方法。

本发明通过如下技术方案完成：可溯源酶校准物质的制备方法包括：1、人源性血清酶基因克隆以及表达；2、高纯度基因重组血清酶的纯化；3、互换性良好的基质物质制备；4、校准物质候选物互换性验证；5、分装后均一性测定；6、冷冻干燥。

所述的人源性血清酶基因克隆以及表达是：酶基因表达载体pET21b-HMCK具体构建过程以及蛋白质优化表达。

所述的高纯度基因重组血清酶的纯化主要通过三个反应步骤完成酶的高纯度蛋白：第一分级分离；阴离子交换层析；第三分子筛凝胶层析；然后测定并去除杂酶。

所述的互换性良好的基质物质制备是以健康人血清为基质原料制备各种血清酶的校准物质，希望得到与临床各种血清样本互换性好的较准物质；它包括基质物质制备和酶血清基质物质评估。

所述的校准物质候选物互换性验证主要包括：血清基质成分酶标准物质和校准物质候选物互换性分析

所述的分装及均一性测定，它是在无菌条件下，以经过计量的移液枪进行定量分装，分装后随即取样20瓶，用cfas作为校准品，采用Roche-7170系统常规方法进行测定；分别测定20瓶样本的混合瓶样本以及单瓶样本；其中混合瓶样本测定40次，单瓶样本各测定2次。经过统计后确定分装样本是否均匀；所述的冷冻干燥是在确认样本均一性良好的基础上，于-80℃预冻10小时，立即转入真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥，完毕后进行在位压盖并于-20℃下保存。

本发明克服了现有技术存在的不足，具有方法可靠，用途广泛，有良好互换性和可溯源性等特点。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍：可溯源酶校准物质的制备方法包括：1、人源性血清酶基因克隆以及表达；2、高纯度基因重组血清酶的纯化；3、互换性良好的基质物质制备；4、校准物质候选物互换性验证；5、分装后均一性测定；6、冷冻干燥。

所述的人源性血清酶基因克隆以及表达是：酶基因表达载体pET21b-HMCK具体构建过程以及蛋白质优化表达。

所述的高纯度基因重组血清酶的纯化主要通过三个反应步骤完成酶的高纯度蛋白：第一分级分离；阴离子交换层析；第三分子筛凝胶层析；然后测定并去除杂酶。