[发明专利]近江牡蛎体内抗人类肿瘤HL60的sTRAIL蛋白质及其引物

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种近江牡蛎体内抗人类肿瘤急性早幼粒白血病细胞株 (HL60)的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可溶性细胞因子蛋白质及其引物。

背景技术

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)， 又称为凋亡素2配体(APO2 ligand，APO-2L)(Wiley et al.，1995；Pitti et al.，1996)， 其胞外结构域在金属蛋白酶的作用下，可降解形成可溶性的细胞因子sTRAIL(Soluble TRAIL)，sTRAIL具有TRAIL的生物学功能(Bodmer et al.，2000)。TRAIL是TNF超家族 中一类重要的跨膜细胞因子(Wiley et al.，1995；Pitti et al.，1996)，可选择性地引起人 类大多数肿瘤细胞发生细胞凋亡：包括脑、肾、肝、肺、胃、结肠、乳腺、前列腺、胰腺、 胆管、宫颈、皮肤和造血系统来源的肿瘤细胞，而对正常细胞无或仅具有极低的毒性(Dphil， 2007；马远方，2007)。

我国是水产大国，牡蛎等贝类养殖是我国海水养殖的支柱产业之一。根据联合国粮农组 织(FAO)的数字显示，我国每年牡蛎的产量具全世界首位，达到300多万吨(湿重)，占 我国海洋水产养殖总产量(约1000万吨)的约三分之一。牡蛎不仅肉质细嫩、肉味鲜美、 营养价值高，还具有抗癌降血脂等功效，有“海洋牛奶”之美誉，是世界性的水产佳肴。目 前国内外通过提取牡蛎等贝类体内的多糖等生物活性物质，并开发出了保健食品。但以上多 为多糖等物质的混合物，是免疫调节产品，并且基础研究资料少，对肿瘤细胞的毒性作用较 低，对其功效及副作用等所知不多。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供了一种近江牡蛎中肿瘤坏死因子相关凋亡 诱导配体可溶性细胞因子蛋白质及其引物。

为达到以上目的，本发明是通过这样的技术方案来实现的：提供一种近江牡蛎体内抗急 性早幼粒白血病细胞株(HL60)的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可溶性细胞因子蛋白质， 具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种编码前述蛋白质的基因，该基因具有SEQID NO：1所示的核苷酸序 列。

本发明还提供了一种用于扩增前述蛋白质的基因的寡聚核苷酸引物，其结构为：

TRAILf：5’-GTGAGAGAAAGAG-3’

TRAILr：5’-TTAGCCAACTTAAAAG-3’。

本发明的有益效果在于：

本发明利用基因工程技术开发的牡蛎中sTRAIL蛋白质产品，对HL60肿瘤细胞具有杀伤 性强、特异性高、安全性好、能够大量生产、易于贮存等优点。

具体实施方式

本发明的下述实施例所使用分子生物学的方法均为已知的技术。

本发明中，近江牡蛎sTRAIL蛋白质即肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可溶性细胞因子 蛋白质，简称CasTRAIL，其中Ca代表近江牡蛎，sTRAIL代表肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配 体可溶性细胞因子；HL60即急性早幼粒白血病细胞株。

本发明的实现步骤包括：

1、以近江牡蛎cDNA为模板，设计扩增sTRAIL蛋白质基因的引物，获得编码sTRAIL蛋 白质的基因全序列。

2、利用DNA重组技术将sTRAIL基因片段克隆到合适的pMD19-T载体(购自Takara公 司，日本)中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET-28(a)原核表达载体(购自 Novagen公司，美国)相连接，获得表达载体pET-28a(+)-sTRAIL。

3、sTRAIL蛋白质的体外诱导表达，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹 (Western blot)等方法鉴定目的蛋白质。

4、利用亲和柱分离纯化目的蛋白质，获得重组的sTRAIL蛋白质。

5、培养急性早幼粒白血病细胞株HL-60(购买自中国科学院上海细胞生物研究所，中国)， 添加纯化的近江牡蛎sTRAIL(CasTRAIL)重组蛋白质，培养细胞0-24小时。

6、分别收集细胞，利用以下两种方法鉴定HL60细胞的凋亡：用流式细胞仪检测 凋亡率；提取DNA检测DNA ladder的形成。