[发明专利]鲍鱼HINT基因、蛋白质及其在制备抗癌药物中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及鲍鱼体内的鲍鱼HINT基因、蛋白质及其在制备抗癌药 物中的应用。

背景技术

组氨酸三聚体核苷结合蛋白质(Histidine triad nucleotide binding protein，HINT) 是组氨酸三聚体蛋白超家族的成员，是一个具有核苷酸转移酶和水解酶活性的家族，晶体结 构研究结果表明，HINT是其它四种组氨酸三聚体蛋白质超家族成员的祖先。自从HINT在牛 中被分离出来并被证明具有生物学功能后，许多HINT的同源物也依次从兔、人、甚至植物 中被克隆出来。研究表明该蛋白质在低等动物和高等动物中具有很高的结构和功能相似性， 而结构和功能的保守性，预示了HINT发挥着重要的生物学功能。研究报道表明，HINT蛋白 质参与了重要的生物学功能，包括物质代谢、转录调控、细胞生长、细胞凋亡等。目前，有 研究报道哺乳动物HINT在肿瘤细胞凋亡、肿瘤发生、发展中发挥了重要作用，而在无脊椎 动物中，HINT的研究只是停留在序列分析上，尚没有报道证实无脊椎动物HINT的存在，功 能研究也有待于进一步探讨。

鲍鱼是一种重要的经济贝类，素称“海味之冠”，自古以来就是海产“八珍”之一。其 味道鲜美，营养丰富，含有较多的钙、铁、碘和维生素A等营养元素。除了具有较高的营养 价值外，鲍鱼还具有较高的医药价值：鲍鱼能养阴、平肝、固肾，可调整肾上腺分泌，具有 双向性调节血压的作用。另外，鲍鱼体内还存在一些能抑制癌细胞细胞代谢的物质。但是， 由于对其相应的功能因子的研究并不深入，尤其是对一些人类肿瘤治疗有益的基因研究较 少，从而限制了其进一步的发展利用。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供了鲍鱼HINT基因、蛋白质及其在制备抗 癌药物中的应用。

为达到以上目的，本发明是通过这样的技术方案来实现的：提供一种鲍鱼HINT基因编码 的蛋白质，具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种编码前述蛋白质的基因，该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序 列。

本发明还提供了前述蛋白质在制备抗癌药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明获得了鲍鱼HINT的基因核苷酸全序列，并通过构建原核表达载体，表达了可溶 性的HINT蛋白质产品。该蛋白质具有促肝癌细胞凋亡作用，可以作为诱导细胞凋亡的组份 而在制备抗癌药物中应用。

具体实施方式

本发明的下述实施例所使用分子生物学的方法均为已知的技术。

本发明的实现步骤包括：

1、以鲍鱼血淋巴细胞总RNA为模板，构建鲍鱼cDNA文库，获得HINT的基因核苷酸全 序列。

2、利用DNA重组技术将HINT基因编码框的序列片段克隆到合适的pMD18-T载体(购自 Takara公司，日本)中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET-28(a)原核表达载 体(购自Novagen公司，美国)连接，获得重组表达质粒pET-28(a)-HINT。

3、将阳性重组质粒PET-28(a)-HINT转化到表达宿主菌BL21(购自Tiangen公司，德 国)，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(购自Sangon公司，加拿大)诱导表达，SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳(SDS-PAGE)进行检测。

4、将阳性表达菌液扩大培养，利用蛋白质纯化试剂盒分离纯化重组蛋白质，并进一步 利用质谱技术鉴定纯化蛋白质。

5、培养肝癌细胞株Bel-7402(人肝癌细胞系Bel7402购自中国科学院上海细胞生物研 究所)，并用纯化的蛋白质HINT进行温浴反应、处理。

6、选择不同的时间点收集处理过的细胞，分别用扫描电镜、流式细胞仪及免疫印迹检 测肿瘤细胞的凋亡情况。

具体的操作步骤如下：

1、鲍鱼血淋巴细胞cDNA文库的构建及筛选

提取鲍鱼血淋巴细胞总RNA，根据SMART^TMcDNA library construction kit(BD Clotech 公司)构建cDNA文库。利用引物PTriplEx2-F，5’-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3’和 PTriplEx2-R，5’-TAATACGACTCACTATAGGGC-3’对文库阳性质粒进行PCR扩增并测序。