[发明专利]源于成形组织的间充质干细胞的分离和纯化方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种源于成形组织的间充质干细胞的分离和纯化方法。

(二)背景技术

人体的各种组织都有可能存在着具有一定分化潜能的干细胞。相关的研究已经表明，除了骨髓和脐带血之外，在其他的成形组织中，例如脂肪、新生儿脐带以及胎盘等，也存在着可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等的干细胞，这些干细胞被统称为间充质干细胞(MSCs)。这些间充质干细胞都可能将在医学上具有细胞移植和组织工程化的重大利用价值。

由于目前还尚未发现间充质干细胞专一的特异性标记分子，因此该干细胞的分离纯化采用的还是间接的方法：即采用贴壁粘附的方法进行筛选和纯化。对于液体组织(例如骨髓和脐带血)来源的间充质干细胞，通常采用分离液体组织中的单个核细胞，并在进行贴附培养的基础上，利用间充质干细胞的贴附性，在细胞培养瓶内贴壁形成纺锤状或纤维状细胞，并经过传代贴壁来逐步纯化间充质干细胞。对于成形组织(例如脐带和胎盘等)，一种方法是将组织剪切成碎块后直接进行贴附培养，然后分离纤维状细胞；另一种方法是采用胶原酶或胰酶消化组织块后收集分散细胞，再行贴附培养方法进行间充质干细胞分离和纯化。成形组织中间充质干细胞的这两种方法简单方便，但是这两种方法分离的细胞实际上是多种细胞的混合物，其中混有大量的内皮细胞或成纤维细胞，而非单纯的间充质干细胞。这种多细胞混合物的继代培养和扩增能力较低，难以形成真正的间充质干细胞株系。目前已有研究根据间充质干细胞表现为CD31^-、CD34^-、CD45^-、CD29⁺、CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺和CD166⁺的特点，采用在细胞原代贴附培养、积聚一定的细胞数量基础上，再利用特异的抗体标记免疫磁珠进行分选，能有效地提高胎盘间充质干细胞的纯化率。但是，这种分离纯化方法比较烦琐、成本比较高，并且不适用于大量成形组织间充质干细胞的分离纯化。

因此，如果能在成形组织的间充质干细胞分离纯化中采用一种既分离纯化效率高，又简便快捷、成本低廉的方法，则对今后大量分离成形组织中的间充质干细胞具有重要的实际应用价值。

(三)发明内容

为了有效提高成形组织中间充质干细胞的体外分离纯化效率，本发明依据成形组织中不同种类细胞的贴附能力差异，进行分时间段贴壁筛选，目的是提供一种便捷有效的成形组织间充质干细胞分离和纯化方法。

本发明采用的技术方案是：

一种源于成形组织的间充质干细胞的分离和纯化方法，所述方法包括：

(1)取成形组织碎片用胶原酶消化，获得悬浮细胞，收集所述的悬浮细胞于培养液a中进行贴壁培养4～10小时，收集未贴附的细胞，贴壁细胞备用；

(2)将步骤(1)获得的未贴附细胞转移至细胞培养液b中贴壁培养，贴壁培养时间为步骤(1)所述的贴壁培养时间的1.5～2.5倍，再次收集未贴附的细胞，贴壁细胞备用；

(3)步骤(2)获得的未贴附细胞重复步骤(2)的操作1～5次，每次各自贴壁培养时间为前一次的贴壁培养时间的1.5～2.5倍，获得不同时间段贴附的贴壁细胞；

(4)对不同时间段获得的贴壁细胞分别培养扩增，并分别进行间充质干细胞特异表面抗原检定，筛选获得具有间充质干细胞表面抗原特性贴壁细胞的最佳贴壁培养时间段；

(5)取在最佳贴壁培养时间段贴附的贴壁细胞，悬浮于细胞培养液c中进行克隆培养，获得纯化的成形组织间充质干细胞。

本发明关键在于依据成形组织中不同种类细胞的贴附能力差异，进行分时间段贴壁培养筛选以获得最佳贴壁时间段的贴附细胞，培养过程中的其他参数，均可采用本领域常规手段进行。