[发明专利]乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种水产动物发育及核行为观察的荧光染色方法，特别涉及乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法。

背景技术

乌贼，俗称墨鱼，属头足纲，十腕目。乌贼肉含有多种氨基酸，营养丰富，肉味鲜美。乌贼墨有凝血作用，主要用于止血，治疗血性疾病；还可保护造血干细胞，含有抗癌物质，具有抗肿瘤活性；乌贼骨称海螵蛸，具有收敛、制酸、止血等功效，曾是我国的四大渔业对象之一，对温度的适应性较强，在我国沿海分布很广，是一种经济价值很高的传统渔业种类。由于过度捕捞和生态恶化，自20世纪70年代以来，先后出现了衰退现象。有关乌贼胚胎发育及核行为的基础研究，国内外报道都很少。对乌贼的胚胎发育及核行为观察，旨在为乌贼基础生物学研究积累资料，为乌贼的苗种生产及后续的增养殖提供理论依据。研究人员在观察了乌贼幼体的胚胎时，由于在镜检时过程中乌贼墨颜色为黑色，会严重影响肉眼的镜检的准确性，所以需要一种新的方法来解决这一问题，另外普通肉眼镜检方法必需剥去受精卵的卵膜，而破坏受精卵表面存在的物质及结构，甚至导致整个卵变形，严重影响观察结果的客观性。

发明内容

本发明的目的是提供乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，以此解决乌贼墨影响镜检效果、普通镜检完全卵膜而破坏受精卵表面存在的物质及结构的技术问题，并且该操作方法步骤简单，操作方便，可以迅速、清晰且直观的在荧光显微镜下观察到乌贼卵的胚胎发育与核行为。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，其具有如下步骤：

①选取乌贼卵，剥离外层卵膜并且只保留最内一层卵膜；

②将步骤①处理后的乌贼卵浸没在固定液中4℃保存，并且保存期间更换固定液2次至4次；

③将经步骤②固定的乌贼卵用缓冲液冲洗2次至3次后，再用荧光染色剂进行染色，并且染色过程在黑暗环境下进行；

④将经步骤③处理后的乌贼卵的动物极小头切下，平铺在载玻片上，并在荧光显微镜下拍照成像。

为优化上述技术方案，采取的技术措施还包括：

步骤②中固定液按重量分数含有戊二醛2份至4份、多聚甲醛2.5份至5份、过滤海水90份至96份。

步骤③中的染色剂为4，6-二脒基苯基吲哚，染色时间为30min至50min。

步骤③中的染色剂为Hoechst33258荧光染料，染色时间为5min至8min。

缓冲液为pH7.4的磷酸缓冲液。

步骤④中，荧光显微镜的观察波长为360nm至370nm。

步骤①乌贼卵的长径为7.5mm至15.0mm、短径为6.5mm至9.0mm；乌贼卵的内的卵黄长径为3.0mm至3.6mm、短径为2.3mm至2.9mm。

过滤海水中含有磷酸缓冲液，并且磷酸缓冲液在过滤海水中的浓度为0.1mol/L。

过滤海水中含有1g/m³至100g/m³的EDTA钠盐。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.将受精卵进行固定，可以在很长的时间内进行观察，不受胚胎发育时间的限制，且卵形保存完整，避免活体卵质地较软操作不便的影响。

2.此方法可以解决卵为非透明的乌贼的胚胎观察时所遇到的必须剥去卵膜造成受精卵表面存在的物质及结构遭到破坏问题。

3.荧光染色后在观察前用锋利薄刀片将卵的动物极小头切下，平铺在载玻片上，利于观察，由于选取的避免了卵个体适中，可以有效避免椭球形无法在玻片上观察到动物极发育的过程的缺陷。

4.本发明方法的步骤简单，操作方便，可以迅速、清晰且直观的在荧光显微镜下观察到乌贼卵的胚胎发育与核行为。

附图说明

图1是本发明实施例的乌贼胚胎核行为观察效果图。

具体实施方式

以下结合附实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：乌贼胚胎发育及核行为观察的荧光染色方法，其具有如下步骤：

①选取乌贼卵，剥离外层卵膜并且只保留最内一层卵膜；

②将步骤①处理后的乌贼卵浸没在固定液中4℃保存，并且保存期间更换固定液3次；

③将经步骤②固定的乌贼卵用缓冲液冲洗3次后，再用荧光染色剂进行染色，并且染色过程在黑暗环境下进行；

④将经步骤③处理后的乌贼卵的动物极小头切下，平铺在载玻片上，并在荧光显微镜下拍照成像。

步骤②中固定液按重量分数含有戊二醛2份、多聚甲醛2.5份、过滤海水95.5份。