[发明专利]水体环境中铜绿微囊藻噬藻体的巢式PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及利用分子生物学技术对水体环境中铜绿微囊藻病毒(噬藻体)进行检测和评价的方法。

背景技术

蓝藻是一类原核光合自养生物，具有细菌的一些特征，因此又常常把蓝藻称为蓝细菌(Cyanobacteria)，同噬菌体一样，感染蓝细菌的病毒就被称之为噬藻体(Cyan-ophage)。噬藻体在海洋与淡水中都大量存在，并且蓝藻水华消退前后其含量有十分明显的变化，因此噬藻体可能是控制蓝藻水华生消的重要生态因子。

自上世纪90年代，人们发现噬藻体丰富存在于海洋中，并且其在水生态系统中具有重要作用。由于各种现代实验技术的运用，现今在噬藻体的生态，分子生物学以及与蓝藻水华关系的研究上已取得一些阶段性成果。但是噬藻体的研究范围非常广泛，从宏观的生态学到分子生物学多个学科都有涉及，且有待解决的问题也很多，比如噬藻体数量及其时空分布、分子进化与遗传多样性、噬藻体的生物学功能基因(特别是感染和裂解宿主的功能)等等。未来将着重利用分子生物学方法对噬藻体分布、丰度和遗传多样性、与宿主在分子水平上存在何种依存或制约关系、对初级生产力和水华的种群结构的调节作用以及实时定量检测的研究，并将噬藻体作为防治蓝藻类水华的有效生物调控因子加以利用。在加强噬藻体各方面基础研究的同时，着重研究其在水华形成与消退过程中所起的作用。

微囊藻是一类全球性分布的蓝藻类。它们是在富营养化湖泊中形成“水华”进而对生态环境造成严重影响的主要藻类。国内外许多湖泊均因该藻的大量繁殖形成水华而造成大面积的水体生态破坏。滇池外海水域每年爆发的“水华”现象，就是以微囊藻为优势种的藻类大量繁殖所致，其中尤以铜绿微囊藻在数量和发生频率上占绝对优势。有研究结果显示：在滇池中形成水华的是微囊藻属和束丝藻属。水华蓝藻总数为3.445×10⁶～1.081×10⁹L^-1。年平均为1.31×10⁸L^-1。占浮游植物细胞总量的66.44％～90.66％。微囊藻属的数量为3.445×10⁶～1.031×10⁹L^-1。年平均为1.25×10⁸L^-1，占浮游植物总数的35.69％～87.97％，是滇池浮游植物群落的单优势属。水华蓝藻数量的时空分布与微囊藻属一致，7月最高，1月最低；近岸带高于湖心，湖北部高于湖中部高于南部。束丝藻属的数量3月最高，1月最低；湖北部高于南部高于中部。微囊藻水华全年可见，束丝藻属仅在3月形成零星的小面积水华。

上世纪九十年代，噬藻体分子生物学的研究对象主要局限于海洋噬藻体，研究深度局限于利用衣壳组装蛋白基因进行病毒检测、生态分布和遗传多样性分析。进入21世纪以来对淡水噬藻体的研究也得到了其应有的重视，一些现代的研究技术也被运用到噬藻体的研究当中。由于噬藻体是高度差异性病毒类群，因此寻找噬藻体较为广泛的遗传标记成为近年来噬藻体分子生物学的关键。然而现有技术中未见有利用巢式PCR特异扩增的方法对能引起水体蓝藻水华的最主要的铜绿微囊藻的噬藻体进行检测方法的报道。

发明内容

本发明目的旨在利用铜绿微囊藻噬藻体Ma-LMM01的g91基因片段设计两对巢式PCR引物CYF_外/CYR_外、CYF_内/CYR_内。利用巢式PCR特异扩增的方法对能引起水体蓝藻水华的最主要的铜绿微囊藻的噬藻体进行检测。

本发明的上述目的是通过下述的技术方案得以实现的：

水体环境中噬藻体的巢式PCR检测方法，包括基于铜绿微囊藻噬藻体Ma-LMM01的g91基因片段，设计巢式PCR引物；提取待检水样浓缩液中噬藻体DNA基因片段；利用引物对该基因片段进行巢式PCR外围引物和内围引物扩增；PCR产物的纯化和测序；进行多重序列比对分析。

内外两对特异性扩增噬藻体g91基因寡聚核苷酸的巢式PCR引物CYF_外/CYR_外和CYF_内/CYR_内为：

CYF_外：5’-CTT CTCGGACTTTGCGTATCGC-3’

CYR_外：5’-TCTGGTTAGGTAGGTCGCCGCTA-3’

CYF_内：5’-CTTCTGCATCCCTCACATTCTCTGGT-3’