[发明专利]一种培育抗黄萎病的转基因植物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种培育抗黄萎病的转基因植物的方法。

背景技术

棉花黄萎病(Cotton Verticillium Wilt)是一种侵害棉株维管束的真菌性病 害，具有分布广、危害重、寄主范围宽、传播途径多、存活时间久的特点。由于生 产上一直没有找到理想的防治和控制方法，其被称为棉花的“癌症”。我国的黄萎 病自1935年由美国引进品种传入，先后在陕西泾阳、山西运城、山东高密和河南 安阳等地发生；1993年棉花黄萎病在我国大范围爆发，北方棉区重病棉田棉花病株 率达50％，当年全国发病面积为26.67万公顷，损失皮棉逾1亿公斤；2002、2003 年棉花黄萎病在黄河流域和新疆棉区再次爆发。化学防治黄萎病的方法成本较高， 污染环境，且防治效果不理想；而常规育种也难以培育出相对病指低于20的抗性 品种。随着分子植物病理学和基因工程技术的迅猛发展，运用转基因技术提高植物 的抗病性已成为棉花抗病育种的重要手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培育抗黄萎病的转基因植物的方法。

本发明提供的培育抗黄萎病的转基因植物的方法，是将含有细胞凋亡抑制基因 的重组表达载体导入目的植物中，得到抗黄萎病的转基因植物；所述转基因植物对 黄萎病的抗性高于目的植物；

所述细胞凋亡抑制基因是iap基因和p35基因；所述iap基因的序列如序列表 中序列1的自5’端第7-813位所示、所述p35基因的序列如序列表中序列2的自5’ 端第7-906位所示；所述重组表达载体的出发质粒是pCAMBIA1301。

所述重组表达载体的构建方法如下：

将通过EcoR I和Pst I双酶切载体pBI121-p35得到的含有p35基因的片段插 入载体p1301-iap的多克隆位点中，得到所述重组表达载体(命名为 p1301-iap-p35)；

所述载体pBI121-p35是将p35基因插入载体pBI121的BamH I和Sac I酶切 位点之间得到的重组质粒。

所述p1301-iap是将iap基因是插入载体pCAMBIA1301的Bgl II和Eco91 I 酶切位点之间，得到的重组质粒。

上述目的植物可以是任何可感染黄萎病的植物，具体可为棉花、辣椒、茄子或 黄瓜。上述棉花是中棉所39。

上述的方法在培育植物新品种中的应用也属于本发明的保护范围之内。

上述植物新品种具体可以是抗黄萎病的棉花新品种，上述棉花是中棉所39。

实验证实：将本发明的重组载体导入棉花中，得到15株转基因棉花株系，经 潮霉素筛选后得到12个阳性株系，对这12个阳性株系的T₃代依次进行了潮霉素 筛选、PCR、RT-PCR、Western blot以及病圃筛选，筛选到抗病指数均在3-10之间 的高抗黄萎病棉花株系。

附图说明

图1为载体p1301-iap-p35的构建流程图，a是载体p1301-iap的构建，b是 载体pBI121-p35的构建，c是p1301-iap-p35的构建。

图2为T3代转基因棉花病圃抗病性检测，(a)为未转化的棉花单株，(b)为转 基因棉花单株。

图3为T3代转基因棉花的RT-PCR检测，(a)为p35基因RT-PCR扩增产物电泳 图，(b)为iap基因RT-PCR扩增产物电泳图，1为未转化的棉花RT-PCR产物(阴性 对照)，2-4为转基因棉花RT-PCR产物，5为质粒p1301-iap-p35的PCR产物(阳 性对照)，6为1kb DNA ladder，由下到上分别为250bp，500bp，750bp，1000bp， 1500bp，2000bp。

图4为Western blot检测T3代转基因棉花叶片中的p35蛋白和iap蛋白，(a) 为T3代转基因棉花叶片中的p35蛋白，(b)为T3代转基因棉花叶片中的iap蛋白， 1-3为转基因棉花，4为未转化棉花(阴性对照)，6为蛋白分子量标准(a)由下 到上分别为16.5kDa，25kDa，32.5kDa，47.5kDa，62kDa，(b)由下到上分别 为16.5kDa，25kDa，32.5kDa。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。