[发明专利]一种抗持留状态结核分枝杆菌的药物筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种药物的筛选方法，具体地，涉及抗持留状态结核分枝杆菌药物的筛选方法。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一种严重危害人类健康的慢性传染性疾病。长期以来，人们对抗结核病的主要手段就是运用抗生素进行化学治疗，这种治疗手段一度有效地控制了结核病在世界范围内的传播和蔓延。然而近年来，原本已被有效控制的结核病大有卷土重来之势，其发病率和死亡率均明显回升，已成为与艾滋病、疟疾并称的传染病。结核病死灰复燃的原因很多，包括人口流动性加大、HIV感染者增多以及多重耐药菌不断出现等。除此之外，结核病难以彻底治愈、容易复发，还与结核分枝杆菌能够以“持留”状态长期存在有密切关系。

感染人体的病原菌根据其与宿主细胞的关系可以分为胞外感染菌和胞内感染菌两类，结核分枝杆菌就属于后者。当其入侵机体后，巨噬细胞可以将其吞噬并形成“吞噬体”。一般说来，吞噬体形成后会与溶酶体迅速融合，由溶酶体产生的各种酶将其消化。而结核分枝杆菌在被巨噬细胞吞噬后，可以通过自身产生并分泌的一些物质，阻止吞噬体的成熟及其与溶酶体的融合，从而使其自身免遭转运至溶酶体最终被降解的命运，而在巨噬细胞内长期存留下来。此时的结核分枝杆菌，代谢活动降至最低，生长繁殖几乎停止，不易被抗菌药物杀灭，这种类似于休眠的长期存活状态被定义为“持留”状态，这种状态的结核分枝杆菌被称之为持留菌，这是结核分枝杆菌逃避宿主免疫系统的进攻和抵抗药物作用的一种手段。当机体免疫力下降，如被HIV感染、服用抗炎药物或免疫抑制剂后，持留状态的细菌又可恢复其生长繁殖活性，恢复致病力。结核杆菌之所以可以形成持留状态长期存活，其原因是复杂的，涉及多方面的机制。近年来的研究表明，这种状态的形成和维持，与其产生的蛋白激酶G(PknG)——一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶有密切关系。

结核分枝杆菌基因组共编码11种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分别命名为PknA～B、PknD～L。它们与真核生物的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶一样可以催化底物蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基发生磷酸化。其中，PknG可以介导结核菌持留状态的形成和维持。巨噬细胞在吞噬外来的病原微生物后形成初级吞噬体，初级吞噬体经过与胞内其他囊泡的一系列融合过程，特别是与溶酶体融合后，最终形成吞噬溶酶体，通过其中的水解酶类将吞入的病原菌消化，这一系列过程称为吞噬体的成熟。吞噬体的成熟过程涉及巨噬细胞内的多条信号传导通路，每条通路都受到胞质内的一些酶或者蛋白因子调控。PknG通过使胞质内某些与吞噬体成熟有关的关键蛋白质磷酸化来阻断吞噬体的成熟过程，从而使被吞入的结核菌免遭降解的命运，在巨噬细胞内长期存活下来，而pknG基因突变的菌株则不能以持留状态在宿主细胞内存活。

鉴于PknG对于结核分枝杆菌持留状态的形成和维持有如此重要的作用，若能找到针对PknG特异而有效的抑制剂，则可以抑制结核分枝杆菌的持留，从而为解决结核长期潜伏性感染这一难题打下基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选抗持留状态结核分枝杆菌药物的方法，具体地讲是一种以PknG为靶点，通过体外筛选PknG抑制剂来筛选抗持留状态的结核分枝杆菌药物的方法。

本发明通过将待测样品与PknG接触，筛选能够抑制PknG活性的待测样品，即为抗持留状态结核分枝杆菌的药物。

具体地说，将待测样品适当稀释后加入到如下反应体系中作为样品实验组：

反应物                终浓度

Hepes                 50～150mM

ATP                   25～75mM

PEP                   0.5～1.5mM

NADH                  0.5～1.5mM

PknG                  1～3μg/100μl

丙酮酸激酶            0.5～1.5U/100μl

乳酸脱氢酶            0.5～1.5U/100μl

同时以不添加待测样品组作为阴性对照，与阴性对照组相比单位时间内OD₃₄₀值的变化越小，则对PknG的抑制率越高。待测样品的终浓度可以是25～75mg/ml，可以根据具体的检测对象稀释到不同的浓度，例如可以设置多个浓度梯度来考察待测样品对PknG的抑制。

优选的所述反应体系如下：