[发明专利]一种产L-苹果酸的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产L-苹果酸的基因工程菌，以及该基因工程菌的构建方法和用途，特别涉及利用基因工程技术对生产L-苹果酸涉及的关键酶进行改造，提高L-苹果酸发酵水平。

背景技术

L-苹果酸主要应用于食品工业，它是一种优良的酸味剂和保鲜剂。在各种果酒，乳酸菌发酵饮料，人造奶油中添加L-苹果酸可最大限度保持天然果汁的风味。L-苹果酸酸味刺激较为缓慢，且保留时间长，酸味比柠檬酸强20％，其与合成甜味剂一起使用还可消除后苦味，因而越来越为消费者所喜爱，L-苹果酸和柠檬酸按合适比例添加到果汁中，可以使果汁更加接近于天然风味。

L-苹果酸是三羧酸循环(TCA)的重要中间代谢物，可直接参与人体的代谢，可用于辅助治疗贫血，肝功能不全和肝衰竭等疾病，因此在医药工业上也有重要的应用价值。

L-苹果酸在细胞能量产生过程中发挥着重要的作用，L苹果酸能诱导皮肤细胞的分裂，改善皮肤组织的生长，因而还可以用于化妆品工业。

由于L-苹果酸的诸多优良特性，使其成为具有巨大应用前景的功能性食品添加剂，医药原料药。

现有的L-苹果酸生产技术主要有固定化细胞生物转化法，生物酶法，化学合成法，微生物发酵法等，其中微生物发酵法最具应用前景。固定化细胞(酶)法生产工艺转化率比较低，生产流程长，转化液中产物含量不高，后提取成本较高。且生物酶转化法使用的前体物质富马酸盐的用量大，原料来源窄。化学合成的苹果酸存在D-型和L-型两种旋光异构体，需要拆分，成本高，工艺复杂，技术难度大，设备昂贵，收率低，并且还存在废弃物污染问题。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种基因工程菌，其无富马酸酶(FumC)活性，从而使其L-苹果酸的产量得到提高。

本发明的另一个目的在于提供上述基因工程菌的构建方法，通过基因工程改造，使其代谢流在苹果酸向富马酸转化处中断，从而积累目的产物L-苹果酸。

本发明的再一个目的是通过微生物大规模发酵L-苹果酸，以降低L-苹果酸的生产成本。

为实现本发明的第一个目的，本发明提供一种产L-苹果酸的基因工程菌，其出发菌为产琥珀酸的菌，所述菌株的富马酸酶基因(fumC)突变，不具备富马酸酶活性。这种突变可以是移码突变、缺失突变、碱基替换或者插入突变等等，不论何种方法，其最终导致的结果是使该菌丧失富马酸酶活性。优选使fumC基因缺失。

为进一步提高L-苹果酸的产率，本发明利用苹果酸脱氢酶(MDH)表达盒替换富马酸酶基因。所述表达盒优选由该菌内源性启动子与苹果酸脱氢酶基因构成，更优选所述内源性启动子为磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(pepck)的启动子。

本发明产琥珀酸的菌可以是放线菌，也可以是产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)以及大肠杆菌(Escherichiacoli)，或上述的基因工程改造菌。

此外，还可以通过亚硝基胍(NTG)对出发菌进行诱变，经含单氟乙酸钠(SMF)的平板培养基(MB)筛选，获得SMF抗性菌株，这种抗性菌株的PEPCK酶活性得到了显著提高，以这种菌作为出发菌可以进一步提高L-苹果酸的产率。

为实现本发明的第二个目的，本发明提供一种构建上述菌株的方法，包括构建fumC打靶载体，导入出发菌，使fumC产生灭活性突变。如前所述，这种灭活性突变可以是移码突变、缺失突变、碱基替换或者插入突变等致使的FumC的活性丧失。

此外，还可以利用打靶载体将富马酸酶基因fumC替换为苹果酸脱氢酶表达盒。这种表达盒优选采用该菌的内源性启动子，例如使用pepck基因的启动子。

使用本发明构建的基因工程菌进行L-苹果酸发酵表明，与出发菌相比其L-苹果酸的产量显著提高，这表明本发明菌株可广泛应用于L-苹果酸的生产。