[发明专利]从仓储书虱中鉴别啮书虱的引物对及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及从仓储书虱中鉴别啮书虱的引物对及其应用。

背景技术

长期以来，传统的昆虫种类鉴定技术多以成虫的形态特征为依据，无法实现对非成虫态如卵、幼虫和蛹的鉴定，同时难以区分具有细微差异的近似种。自20世纪90年代以来，随着现代分子生物学技术的发展，国内外诸多学者已对多种昆虫进行了分子鉴定方面的探索。利用现代分子生物学进行昆虫鉴定研究时，基因序列的信息代表了遗传本质，不受标本个体发育状态和环境条件影响，能够提供充分的可定量测度的遗传学信息。因此，从分子水平上对书虱进行种类鉴定是一种高效、便捷的方法，尤其是DNA基因序列分析技术的研究与应用，为昆虫分子鉴定揭开了新的篇章。

世界常见的仓储书虱种类包括嗜卷书虱L.bostrychophila Badonnel、嗜虫书虱L.entomophila(Enderlein)、无色书虱L.decolor(Pearman)、小眼书虱L.paeta Pearman、啮书虱L.corrodens(Heymons)、暗褐书虱L.brunneaMotschulsky以及虚伪书虱L.mendax Pearman。其中，仅啮书虱在我国尚未见发生报道，且与嗜卷书虱的形态特征极其近似。

发明内容

本发明的目的是提供一种从仓储书虱中鉴别啮书虱的引物对及其应用。

本发明所提供的从仓储书虱中鉴别啮书虱的引物对，其核苷酸序列分别为序列表中的序列1和序列2。

含有上述引物对的试剂盒也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种从仓储书虱中鉴别啮书虱的方法。

本发明所提供的从仓储书虱中鉴别啮书虱的方法，是以待测仓储书虱的基因组DNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增，检测所述PCR扩增产物，所述PCR扩增产物大小为250-500bp，待测仓储书虱为啮书虱。

其中，检测所述PCR扩增产物的方法可为琼脂糖凝胶电泳检测或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

如果用琼脂糖凝胶电泳检测，由于琼脂糖凝胶电泳的分辨率低，PCR产物大小在250-500bp之间。

本发明解决了长期以来困扰口岸检疫和粮食储藏部门的书虱种类鉴定问题。由于书虱个体微小(约1mm)、玻片标本形态特征把握较为困难、国内外书虱形态鉴定专家屈指可数、鉴定所需时间过长等原因，使书虱形态鉴定存在较大困难。本发明利用DNA基因序列分析技术，在所构建的7种世界常见仓储书虱16S rDNA基因序列信息库的基础上，设计、筛选了用于从仓储书虱中鉴别啮书虱的特异引物，建立了一套从仓储书虱中鉴别啮书虱的方法，实现了从仓储书虱中快速准确鉴别啮书虱，将啮书虱与其余世界常见仓储书虱种类区别开来，具有省时、高效、直观等特点。本发明的从仓储书虱中鉴别啮书虱的方法可在检验检疫部门和粮食储藏部门广泛使用。

附图说明

图1为凝胶电泳检测PCR产物的结果。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明，所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

实施例1、利用特异引物通过PCR从仓储书虱鉴别啮书虱

(1)书虱基因组DNA的提取

采用CTAB法分别提取不同地理种群的单头书虱的基因组DNA，包括采自捷克和美国的啮书虱、采自中国、捷克、美国的嗜卷书虱、采自中国、捷克的嗜虫书虱、采自中国、捷克、美国的小眼书虱、采自中国、捷克、美国的无色书虱、采自捷克、美国的暗褐书虱以及采自中国的虚伪书虱。上述书虱的种类均经形态特征确证。

取待检书虱单头用无水乙醇杀死后，用双蒸水清洗晾干(勿干透)，放入1.5mL无菌离心管中，加入50μl提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，pH 7.0，1.4mol/LNaCl，20mmol/L EDTA，2g/100ml CTAB)研匀；加入1μl蛋白酶K(20mg/mL)，置于60℃水浴锅中保温1h，其间上下混匀3次；加入125μl苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混匀5min，放入离心机中，10000r/min离心15min后取上清液；加入2倍体积的冰冷无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L醋酸铵(pH 7.0)，混匀后置于-20℃8h以上。14000r/min离心10min，用100μl 70％乙醇洗涤1次，37℃干燥后，加入灭菌水10μl室温下溶解DNA。然后置于-20℃保存待用。

(2)PCR扩增