[发明专利]基于pH的反馈补料生产赖氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及发酵法生产赖氨酸的方法，具体地说涉及一种基于pH的反馈控制补加碳源和氮源发酵生产赖氨酸的方法。

技术背景

L-赖氨酸(以下简称赖氨酸)是八种人体必需氨基酸中最重要的一种，它对调节生物体内代谢平衡，提高生物对谷类蛋白质的吸收，改善人类膳食营养和动物营养，促进生长发育均有重要作用。赖氨酸被广泛用作动物饲料添加剂、食品添加剂、药品等。2006年全球赖氨酸的消费量达到85万吨，其中90％的赖氨酸用作饲料添加剂，约5％用作食品添加剂，5％用作医药中间体。

赖氨酸的工业生产始于1958年，日本木下祝郎、中山清等采用紫外线照射谷氨酸棒杆菌得到了一株营养缺陷型突变株，其L-赖氨酸生成量达到工业生产水平。目前，微生物发酵法已成为生产赖氨酸的主要方法，工业生产规模逐年扩大。近年来，随着原材料价格的上涨和市场的激烈竞争，为了提高赖氨酸产率和降低生产成本，仍有大量关于赖氨酸发酵方面的研究报道，主要集中在选育高产赖氨酸菌株、改进发酵工艺和开发新资源等方面。

赖氨酸产生菌属于具有多重遗传标记的突变株，能在胞外大量积累赖氨酸是由于菌体的代谢调节处于异常状态，对环境条件非常敏感。发酵条件如碳源、氮源、无机盐、pH及溶解氧等对赖氨酸的合成有重要影响。其中，底物(葡萄糖)浓度是影响菌体代谢的一个重要参数，它主要通过控制相关酶的合成或活性影响菌体的代谢途径，通常称作葡萄糖效应(俞俊棠，《新编生物工艺学》，化学工业出版社，2003年，110页)。葡萄糖可通过“葡萄糖效应”阻遏、抑制多种酶的合成，如氨基酸合成酶等，这种阻遏作用主要是其分解代谢物引起的。在以葡萄糖为碳源的赖氨酸发酵中，葡萄糖的分解代谢物阻遏会引起多种副产物如丙氨酸等的积累，从而影响糖对赖氨酸的转化率(张克旭，《代谢控制发酵》，中国轻工业出版社，1998年，299页)。

目前，赖氨酸发酵主要采用的是批式发酵模式。在菌体生长阶段需要提供一定浓度的葡萄糖以获得足够浓度的菌体，而在菌体产酸阶段需要维持较低的葡萄糖浓度，这样能够激活赖氨酸合成途径的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，从而强化二氧化碳固定反应，提高赖氨酸产率。为了实现上述发酵模式，在赖氨酸的生产过程中一般采用补料的方法，但是现有的补料方法主要是按照预定程序流加，属于无反馈的流加，虽然操作比较简单，但是不能真实反映发酵过程中葡萄糖浓度的变化；或者靠人工定时取样分析再调整流加速率，糖浓度的控制滞后，导致葡萄糖浓度波动大。另外，由于在线测定葡萄糖浓度有困难，所以目前无法实现在线测定发酵液中葡萄糖的浓度并及时反馈控制。因此在赖氨酸发酵生产过程中，其补料具有盲目性，发酵生产的重复性也较差。

在赖氨酸发酵生产过程中，准确控制及时补加氮源也是十分重要的。在赖氨酸发酵生产的不同阶段，菌体内的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的二氧化碳固定反应与丙酮酸激酶催化生成丙酮酸的途径的分配系数直接影响赖氨酸的得率。由于发酵液中铵根和硫酸根的存在能够激活赖氨酸合成途径中关键酶天冬氨酸激酶(文献Agric.Biol.Chem.，1979，43(12)，P.2480)，有利于解除天冬氨酸对于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反馈抑制，增加二氧化碳固定反应的代谢流量，从而达到强化赖氨酸合成途径的效果，所以发酵液中的硫酸铵浓度与上述的分配系数直接有关，维持适宜的硫酸铵浓度是调节上述两个途径分配系数的关键。因此在赖氨酸的发酵生产中还需要流加氮源硫酸铵和氨，既维持了适宜的pH值，又能够提高赖氨酸的产量。在赖氨酸的发酵生产中目前普遍采用的是按照预定程序或人工定时取样分析后流加硫酸铵，用发酵液的pH值作为反馈信号控制氨的流加。这种方式导致硫酸铵浓度(相当于铵离子摩尔浓度的二分之一，在发酵的pH下，发酵液中氨的存在形态主要是铵离子)的控制也不精确并且重复性差，影响赖氨酸的发酵生产。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有的赖氨酸生产方法在补料时具有盲目性，影响生产控制，使得发酵产量低的缺陷。提供一种通过检测发酵液中的pH变化，利用pH值反馈控制补料，维持一定的葡萄糖浓度和/或维持一定的硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比，从而简化生产工艺，在不增加额外设备的情况下使赖氨酸的发酵产量大幅度提高的pH反馈补料生产赖氨酸的方法。

本发明的目的之二在于上述维持一定葡萄糖浓度和/或维持一定的硫酸铵与赖氨酸摩尔浓度比的基础上，提出了分段控制赖氨酸发酵生产的方法，进一步促进赖氨酸的发酵生产。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：