[发明专利]一种水产动物消化道菌群计数方法及其专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种水产动物消化道菌群计数方法及其专用引物。

背景技术

环境细菌计数方法可分为间接培养计数法、直接计数法(邱大俊，焦念志，钱鲁 闽，2004.水生细菌数量与菌体大小测定技术的进展.台湾海峡，3(3)377-385.)。

间接培养计数法是通过选择性培养基，在适宜的培养条件下培养样品中的细 菌，从而进行活细菌的计数，主要包括平板菌落计数法。平板菌落计数法测定的细 菌数量是样品中可培养细菌的数量，即活菌数。平板菌落计数法具有成本低廉、方 法简单、操作方便的特点，但该法存在如下问题：耗时较长，无菌操作要求严格， 手续繁琐，劳动强度大，测定结果受培养条件等因素的影响；样品中含菌量过少时 并不能代表整个样品的含菌量情况(蒋增辉，王幸艳，2005.介绍几种新的水中细 菌总数检测方法.城市公用事业，19(2)15-16)。

直接计数法可适时、快速、准确地测定细菌总量，主要包括荧光显微镜等技术， 如DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole，4，6-联脒-2-苯基吲哚)染色法。DAPI可 与细胞中的DNA和RNA特异结合，在特定波长光的激发下发出荧光，荧光显微镜下 可观察到染色后的细菌。DAPI染色法能够更好地排除其它微粒的干扰，使背景更清 晰，染色的效果更加专一，且制片后的保存时间更长久(Porter K G，Feig Y S.， 1980.The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnology and Oceanography 25(5)943-948.)(Arend L，ReilM.，1987. Seasonal and spatial distribution of extracellular enzymatic activities and microbial incorporation of dissolved organic substrates in marine sediments. App lied and Environmental Microbiology 53(8)1748-1755.)。

DAPI染色法可成功的应用于水体环境菌群的计数，但是对于复杂环境来源的样 本，如鱼肠道，因其含有大量的消化内容物、肠道上皮组织等，会产生背景干扰色， 严重影响总菌数计数(Sabrina N.Hymell，Craig J.plante.，1998.Improved method of bacterial enumeration in sandy and deposit-feeder gut sediments using the fluorescent stain 4，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI).MARINE ECOLOGY PROGRESS SERIES 173 299-304.)。

实时荧光定量PCR技术(real time fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新技术，是在PCR反应体系 中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对 未知模板进行定量分析(欧阳松应，杨冬，欧阳红生，马鹤雯，2004.生命的化学 24(1)74-76.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种水产动物消化道菌群计数方法及其专用引物。

本发明提供的水产动物消化道菌群计数的专用引物，是序列表的序列1所示核 苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对。

所述专用引物可应用于制备水产动物消化道菌群计数试剂盒。

本发明还保护一种水产动物消化道菌群计数试剂盒，它包括所述的专用引物。

所述专用引物和所述试剂盒均可应用于水产动物消化道菌群计数。

本发明同时保护一种水产动物消化道菌群计数的方法，包括如下步骤：

1)将待测动物的消化道各段及各段内容物作为待测样品；

2)以待测样品的总DNA为模板，用所述专用引物进行荧光定量PCR扩增；

3)对照标准曲线，得到水产动物消化道的菌群数。

制作所述标准曲线所用的样本可为肠道优势菌的混合菌。