[发明专利]禽Ⅰ型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种禽I型马立克病病毒疫苗株基因工程通用载体的构建方法和在获得的重组禽I型马立克病病毒疫苗毒株方方面的应用，属于兽用生物制品领域。

背景技术

马立克病病毒(Marek′s Disease Virus，MDV)，学名为禽疱疹病毒2型(Gallidherpesvirus 2)，是鸡的重要传染病病原，并具有致肿瘤特性(陆承平主编.兽医微生物学.第四版，中国农业出版社，2007，359)。马立克病病毒Marek′s Disease Virus，MDV)引起鸡一种高度接触性传染性肿瘤病，以外周神经、虹膜、皮肤、肌肉和各内脏器官的淋巴样细胞浸润、增生和肿瘤形成为特征，传播速度快、潜伏期长。它在世界范围内流行，使严重危害养禽业发展的三种主要疫病之一。利用血清学技术，可将马立克病病毒其分为3个血清型：I型马立克病病毒强病毒株及其致弱毒株(MDV)，天然不致瘤株(MDV2)，天然不致病的HVT。在MDV基因组中含有许多病毒复制的非必须区，这为重组马立克病病毒的构建提供了理论基础。

在MDV三个血清型的疫苗毒株中，禽I型马立克病病毒更适于构建重组疫苗病毒，如CVI988株比火鸡疱疹病毒(HVT)更具优越性，因为其与流行毒株抗原性更接近，除此以外作为重组病毒载体还具有如下优点：(1)MDV为细胞结合性病毒，可持续感染。经疫苗免疫的鸡可终生带毒，产生持久的免疫力。(2)MDV疫苗接种后，病毒在细胞间传播，因而不受母源抗体的干扰。(3)MDV的基因组较大，可插入多个外源基因，现在已经研究清楚US区有多个外源基因插入位点，在US基因中插入外源基因片段不会影响病毒的复制。(4)该病毒的自然宿主只有禽类，对其它家畜和人类是安全的。

随着对MDV的毒力相关的基因或分子位点和结构研究的深入，研究方向转向马立克病病毒基因工程重组疫苗，即利用已有的马立克病病毒疫苗毒株作为活载体，表达其它病原的保护性抗原基因，如以HVT为载体表达IBDV的VP2基因及NDV F基因等。其技术核心是利用同源重组原理，将外源抗原基因插入MDV中并表达，具有抗多种病毒的效果。重组MDV构建中最关键的一步，是构建MDV转移载体。李永清、周雪媚、张培君等发明的是一种转移载体pUS2-LacZ，其特征在于重组质粒pUS2上的US2基因片段由CMV立即早期启动子、LacZ基因、转录终止信号SV40polyA、氨苄青霉素和新霉素标记基因以及一个多克隆位点基因替换。通过与MDV疫苗病毒同源重组并纯化筛选，获得LacZ标记基因的重组病毒MDV(《重组鸡马立克氏病病毒转移载体及应用》(公开号：CN1763205；)。

现在已有报道的MDV转移载体，筛选基因和标记基因都是单独使用，这造成现有的MDV转移载体，在应用中存在一些问题和缺点。如果单独使用筛选基因，如氨苄青霉素、新霉素标记基因，其缺点在于无法直观显示重组病毒的数量和重组病毒的纯度，造成实验的盲目性。若是单独采用标记基因，如李永清；周雪媚；张培君等单独使用的标记基因是LacZ，缺点在于重组病毒筛选过程中，无法抑制母源MDV的污染，导致不能有效区分重组病毒和母源MDV，影响筛选效率，造成筛选时间长，易失败。另一方面，已有的载体只能允许一个外源抗原基因的插入表达(《重组鸡马立克氏病病毒转移载体及应用》(公开号：CN1763205；)。以上的缺点限制了现在已有转移载体的应用，无法快速构建重组病毒，阻碍了重组MDV的生产应用。

本发明设计所构建禽I型MDV疫苗株基因工程通用载体，可以克服已有MDV转移载体的缺点，从而可以快速构建、筛选获得重组MDV，有利于重组MDV疫苗的研究和应用。

发明内容

本发明的目的是构建一种高效的禽I型MDV疫苗株基因工程通用载体，为重组马立克病毒基因工程疫苗生产用毒株的研制提供新的可靠技术保障。

发明简述

本发明公开了一种高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体构建方法及其在构建疫苗生产用重组马立克氏病病毒上的应用。

本发明公开了构建高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选基因(S-g-n)的如序列1所示的核苷酸序列。

本发明公开了构建高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的筛选同源臂(U)，如序列6所示的核苷酸序列。

本发明公开了构建高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的的表达盒基因，(C-M-A)，如序列9所示的核苷酸序列。