[发明专利]海藻酸钙固定化海洋细菌MP-2酯酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及海洋微生物酯酶领域，特别是涉及海藻酸钙固定化海洋细菌MP-2酯酶的制备方法。

背景技术

微生物酯酶(Esterase，EC3.1.1.1)属于水解酶类(Hydrolases)，来源于微生物体内，指能够催化水解羧酸酯的所有酶的总称。作为生物催化剂，具有很高的催化功能、底物特异性和反应特异性，利用其水解反应、酯转换及酯合成反应广泛应用于医药、化工、食品、能源及环保等领域。尤其是近年来随着非水相酶学研究的不断深入，酯酶在酯类化合物的合成和手性药物的拆分方面已成为国内外的关注热点，显示出潜在的应用前景。而且海洋微生物为适应海洋低温高盐高压这一生命极限环境，海洋微生物酶表现了比陆源性微生物酶更为独特的酶学性质与生理功能。然而，由于游离酯酶的成本、高效性与稳定性等问题的存在，其应用仍然面临诸多困难。因此对于现代工业来说，游离酯酶不是一种理想的催化剂。为了克服其缺点，采用固定化海洋微生物酯酶技术，不仅能保持原酶的特性，而且将会大大提高酶的稳定性，可以连续长期使用而不易失活，也易与产物的分离，利于酶的重复多次使用及产品的纯化，从而显著降低酶的使用成本，因此具有更为广阔的应用前景。

近年来，国内外对固定化酶进行了研究报道认为海藻酸钠是糖醛酸的钠盐聚合物，对生物的毒性较小且不易被降解，用它与钙盐形成的凝胶来包埋酶，凝胶机械强度较好，内部成多孔结构，反应条件温和，操作简单，酶活力的损失小。催化学报，2005，26(11)，P877-981报道以海藻酸钠固定化根霉脂肪酯的制备报道，食品工业科技2006，27(9)，69-71报道海藻酸钠固定化谷氨酰胺转氨酶稳定性的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在诸多缺点，经发明人长期开发研究海洋微生物及其分泌产物和生产实践可以提供一种体系稳定，相容性好，反应温和，酶活率保留高的海藻酸钙固定化海洋细菌MP-2酯酶的制备方法。

本发明提供的海藻酸钙固定化海洋细菌MP-2酯酶的制备方法包括下列步骤：

①海藻酸钠与海洋细菌MP-2酯酶分别溶于0.1mol/L pH10的甘氨酸NaOH的缓冲液中，溶解成溶液后，两溶液在搅拌下充分混合均匀，其中海藻酸纳浓度为2-4质量％，优选为3质量％，海藻酸钠与海洋细菌MP-2酯酶在混合溶液中1∶6至1∶10，优选为1∶8；

②在固定化反应器中，将步骤①的混合溶液在搅拌下逐滴注入CaCl₂溶液中成球，CaCl₂溶液的浓度为1-3质量％，优选为2质量％；成球后在室温下例如25℃下静置进行固定化，固定化时间为30-80分钟，优选为60分钟，然后用蒸馏水洗涤数次，以除去多余离子，冷风吹干后，得颗粒状固定化海洋细菌MP-2酯酶(简称固定化酯酶)，其颗粒大小约为0.5-1.5mm，4℃保存。

本发明提供的海藻酸钙固定化海洋细菌MP-2酯酶的制备方法中，所述海洋细菌MP-2酯酶是由中国水产科学研究院黄海水产研究所从海洋底泥培养分离得到高产酯酶菌株MP-2，称高产酯酶为海洋细菌MP-2酯酶；由黄海水产研究所提供，即商品市售。

酯酶在固定化过程中，随着酯酶量的增加，固定化酯酶的活力呈先升后降的趋势而活力回收率逐渐下降。酯酶与海藻酸钠载体的比例为6∶1至10∶1为8∶1(质量比)时，此时相对酶活力最高。这也许由于随着酯酶量递增，载体上吸附的酯酶增加，使固定化酯酶活力逐渐升高，但是由于载体只能吸附有限的酯酶量，当载体量相对减少时，单位数量的载体所包埋的酯酶量相对较多，造成酯酶分子相互聚集成团，酶分子的活性中心有可能被遮盖，催化活力仍然会下降。因此，只有酯酶与载体适当配比时，才能使固定化酯酶表现出较高的活性。

所述海藻酸钠在酯酶固定化过程中作为载体而存在，海藻酸钠浓度不仅影响凝胶的机械强度，质量传递，进而会影响到固定化酯酶的活力。当海藻酸钠浓度较低时，凝胶孔径较大，凝胶内的酯酶分子容易流失，故酶活力较低；当海藻酸钠浓度过高时，凝胶孔径太小，此时限制了底物及产物的扩散，同样导致酶活力下降。同时浓度过高，虽然凝胶的强度增大，但包埋剂粘性也增加，不便于固定化的操作。因此，载体浓度应控制在适当的范围内，如当海藻酸钠浓度为2-4质量％，优选3.0％时，相对酶活力最高。