[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法，属于兽用 生物制品领域中的疫病诊断技术。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征，又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼 吸道疾病为特征的传染病，是对养猪业威胁较大的传染病。

PRRSV属于套式病毒目，动脉炎病毒科。此囊膜病毒为正股单链RNA病毒，其基因 长度为15kb。目前中国流行的PRRSV病毒毒株为美洲型及NSP2变异的美洲型PRRSV 毒株(高致病性蓝耳病毒株)。目前该病毒的检测方法有RT-PCR方法、细胞分离鉴定和 ELASA等方法。但在实际PRRSV检测工作中，所采用的检测技术手段存在的如下问题： 普通的PCR方法：容易产生假阳性，对模板质量要求高；普通的血清学方法：敏感度不够， 操作繁琐，不适合更高要求的抗原检测工作；细胞分离培养鉴定：周期长，对实验条件要 求苛刻。

环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi等发明的一种新型核酸扩增技术 (Notomi，T.，et al.，Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000， 28，e63.)，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温 条件下可以高效、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。 Masaki Imai等人(2007)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立 了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其他与人类相关的病毒，如病毒性出血性败 血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、 彩虹病毒、人类疱疹病毒8型、造血组织坏死病毒(IHHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黄化 曲叶病毒等。目前国内外均未见有用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP试剂盒 及LAMP方法在猪繁殖与呼吸综合征病毒检测中的应用，也未见有针对PRRSV美洲型经 典毒株和高致病性蓝耳病病毒(NSP2变异的美洲型PRRSV)毒株有效区分的LAMP检测 方法的报道。

本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法避免了上述检 测手段存在的问题，相较其他的检测手段，建立的PRRSV RT-LAMP方法具有特异性强、 敏感度高、检测周期短、操作简单方便的特点，有效的解决了在检测工作中使用的其他技 术手段存在的问题。

发明内容

本发明的目的是建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，特别是可用于区分PRRSV美洲 型经典株和NSP2变异株的RT-LAMP检测方法，并提供一种用于以上目的的RT-LAMP试 剂盒。

本发明的技术方案

本发明的原理及技术路线

本发明将建立针对PRRSV美洲型经典毒株及PRRSV NSP2变异株(高致病性蓝耳病 毒株)环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测方法，本 方法具有多引物同时扩增，并在两端形成了带有引物功能的环状结构，这种多引物结合和 可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等特点，由于RT和LAMP反应在同 管中同时进行简化了操作步骤，同时因为RT-LAMP反应的产物中包含大量核酸和焦磷酸 镁的沉淀，可以用荧光剂显色来验证，并且反应物中的目的片段含有酶切位点，可以用酶 切鉴定、琼脂糖凝胶电泳等办法来验证反应结果，适用于各种实验条件下检测工作的使用。

本发明的方法具体实施

1猪PRSSV RT-LAMP检测方法的建立和验证

(1)反应用试剂的制备

1)引物设计、筛选PRRSV RT-LAMP引物设计与筛选根据GenBank公布的经典的 PRRSV(美洲株VR-2332)、其他4株美洲型毒株及NSP2变异的美洲型PRRSV毒株(高 致病性蓝耳病GD株、北京株)基因序列为模板，在高致病性蓝耳病病毒NSP2变异株缺 失90bp核苷酸序列两侧设计RT-LAMP检测引物，利用LAMP Tubidimeter分析仪对不同 引物的结果反应进行筛选，由其中选出两对引物：

F3：CAGATCCGATTGCGGCAG