[发明专利]一种禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其应用。

背景技术

人禽流感H5N1病毒是一种来源于禽类的高致病性、高致死率的流感病毒亚型。 1997年在香港首先爆发了人禽流感的感染，18人感染，其中6人死亡。到2003年， 世界范围内又重新出现了人禽流感病例。从2003年底至今，已有408例感染，其中 205例死亡。人禽流感的传播方式一般是从禽类传染给人，人和人之间的直接传染只 是偶发现象。但是，一旦病毒通过突变或者与人流感病毒基因发生重排，就可能产生 适应在人体复制和人与人直接传播的新毒株，导致流感大流行。虽然目前没有观察到 H5N1病毒持续的人到人的传播，但是20世纪的3次流感大流行都起源于鸟类的流感 病毒，其中1918-1919年流感大流行夺去了四千万人口的生命。据估计，下一次流感 大流行造成的死亡数字将远高于此。因此，为应对流感大流行做准备是十分紧迫的任 务。

机体的免疫系统是抵御病毒入侵的重要纺线，研制高效的疫苗，激发人体的保护 性免疫反应是防治高致病性禽流感最重要的手段。机体的免疫系统有体液免疫和细胞 免疫两个分支。体液免疫是由抗体介导的。流感病毒通过其血凝素(HA)糖蛋白结合 细胞表面的唾液酸残基而粘附在宿主细胞表面，再通过内吞作用以及随后的病毒囊膜 和宿主细胞膜的融合而进入细胞。病毒HA对于流感病毒致病力和病毒感染的宿主范 围起着关键的作用，同时HA也是体液免疫的主要靶抗原。HA特异性抗体起着阻断病 毒粘附的作用，从而抑制病毒感染细胞。

与体液免疫不同，细胞免疫是由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所介导的。病毒感 染细胞后，病毒蛋白质被细胞内的蛋白酶分解成多肽，被转运到内质网中，再被装载 到主要组织相容性复合体(MHC)I类分子上。然后多肽-MHC复合物通过高尔基体被 转运到细胞表面，再被CTL(CD8⁺T细胞)识别。CTL识别MHC分子提呈的病毒多肽 后，分泌具有抗病毒活性的细胞因子，如IFN-γ和TNF-α，以及具有裂解细胞作用 的穿孔素，从而杀伤被病毒感染的细胞，限制病毒的复制和传播，进而清除病毒。这 些被CTL识别的病毒多肽就是相应的MHC限制性的CTL表位。细胞免疫虽然可能不能 预防病毒感染细胞，但是可以通过清除被病毒感染的细胞防止流感病毒导致的严重疾 病和死亡。

目前禽流感H5N1的检测方法包括病原学方法、血清学方法和核酸检测方法。

通过病毒的分离鉴定是禽流感的经典病原学方法。该方法检测结果准确可靠、灵 敏(极少量病毒也可检出)，但操作程序繁杂、费用高、实验室要求高(国家规定必 须在P3级实验室进行)、耗时费力、周期长(检测时间需1-3周)，大面积应用推广受 到较大限制。

目前共有6种血清学检测技术，分别是：血凝抑制试验(HI)、微量中和试验(MNT)、 免疫荧光技术(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金免疫层析分析(GICA)和蛋 白免疫印迹(western blot)。这些方法都是利用抗原抗体之间的特异性反应，来确定 病毒亚型或者某种亚型特异性抗体的滴度。血凝抑制试验和琼脂扩散实验操作简便快 速，但灵敏度较低。微量中和试验虽然灵敏度高，但操作繁琐耗时。免疫荧光技术灵 敏度高，但需要复杂昂贵的仪器设备，应用受到限制。酶联免疫吸附试验一般被认为 是既简便快捷，又灵敏的方法，但是用于检测抗体时，对抗原制备的要求较高。在这 6种检测技术中，血凝抑制试验和微量中和试验是实验室常规方法，其余4种对于常规 流感甲1和甲3亚型已有完善的方法，但是用于H5抗原的检测还需改进和优化。对于胶 体金免疫层析分析，日本、美国和我国有区别甲型流感、乙型流感和H5亚型的试剂盒， 敏感度不够高。

禽流感病毒的核酸检测技术包括反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时定量 PCR(RTQ-PCR)。该方法不但可鉴定样品中病毒的型及亚型，还可结合基因序列分析推 测病毒的致病力高低。其灵敏度高，较病毒分离法快速、特异性也高，是公认的能够 在较短时间做出准确诊断的方法。但其成本较高，试验过程复杂，对实验环境、仪器 设备、操作人员等要求高，同时干扰因素多，会出现假阴性或假阳性现象，诊断时不 能作为唯一的判定依据。