[发明专利]木糖醇发酵重组酵母菌株的构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及酵母发酵领域，尤其是涉及利用基因工程突变木糖醇脱氢酶基因，构建木糖醇高转化率的重组酵母菌株的方法及应用。

背景技术

木糖醇是一种具有营养价值的甜味物质，是人体糖类代谢的正常中间体，也是防龋齿的最好甜味剂。木糖醇可制成糖尿病人的甜味剂、营养补充剂和辅助治疗剂，在体内缺少胰岛素影响糖代谢情况下，无需胰岛素促进，木糖醇也能透过细胞膜，被组织吸收利用，供细胞以营养和能量，且不会引起血糖值升高，消除糖尿病人服用后的三多症状，是最适合糖尿病患者食用的营养性的食糖代替品。

木糖醇的生产方法包括化学催化加氢法和生物转化法。化学催化加氢法生产木糖醇，不仅工艺复杂、安全性差，而且还必须以纯木糖为原料，成本较高。生物法生产木糖醇的原理是利用细胞内的木糖还原酶，将木糖还原为木糖醇。该工艺流程在常温常压下进行，具有能耗低、设备简单、操作安全等特点。目前生物转化法工艺，首先在培养基中加入葡萄糖和木糖，酵母细胞首先利用葡萄糖生长，然后由酵母细胞把木糖转变成木糖醇。现有的工艺所涉及的木糖转化以及木糖醇进一步代谢过程描述如下：

(1)使用假丝酵母野生型，木糖转化成木糖醇最高得率约70％，其余的部分再由木糖醇进一步转化成维持酵母细胞生长以及新陈代谢的营养成分，如下式所示：

(2)韩国的Ko采用基因工程的方法，敲除木糖醇脱氢酶基因双拷贝。这种方法在木糖醇转化发酵阶段，因为木糖醇脱氢酶基因缺失，酵母细胞不能产生木糖醇脱氢酶，从而导致木糖醇不能转变成木酮糖，需额外添加价格昂贵的甘油作为碳源，维持酵母细胞生长及新陈代谢。

本发明人经多年研究，通过采用基因工程技术突变木糖醇脱氢酶基因，从而构建可获得木糖醇高转化率的重组酵母菌株。所得到的重组酵母菌株中由该突变基因编码的木糖醇脱氢酶变构体酶活力降低，导致木糖醇降解速度减慢，致使木糖产量增加；同时还保证微量的木糖醇继续代谢维持酵母的存活，不必额外添加甘油作为碳源保证酵母细胞的存活，其克服了目前木糖醇生产工艺上的不足，适合工业化生产。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种木糖醇发酵重组酵母菌株的构建方法，其主要是采用基因工程技术，使产木糖醇的酵母细胞中木糖醇脱氢酶双拷贝基因中的第一拷贝完全失活，第二拷贝部分失活，其突变基因编码的木糖醇脱氢酶变构体酶活性大大降低，导致木糖醇降解速度减慢，致使木糖产量增加；同时还保证微量的木糖醇继续代谢维持酵母的存活。

本发明的第二个目的是提供由上述构建方法构建的重组酵母菌株。

本发明的第三个目的是提供一种木糖醇脱氢酶突变基因，其可以直接转化至宿主细胞中，用于构建木糖发酵酵母菌株。

本发明涉及木糖代谢的相关基因和其编码的酶，具体描述是木糖醇脱氢酶基因和其编码的木糖醇脱氢酶，来源于热带假丝酵母(Candida Tropicilis)，但也包括产木糖醇其它的酵母：假丝酵母，如季蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、莫基假丝酵母(Candida mogii)、平滑肌假丝酵母(Candida parasilosisn)；以及部分属于德巴利酵母属，如汉孙德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)；还有管郎酵母属(Pachysolen)。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：首先提供一种木糖醇发酵重组酵母菌株的构建方法，采用基因工程技术，完全突变产木糖醇酵母细胞中的木糖醇脱氢酶双拷贝基因中的第一拷贝；以及突变第二拷贝3′端的60-150个碱基对。

本发明的构建方法，其中所述完全突变酵母细胞中木糖醇脱氢酶双拷贝基因中的第一拷贝的方法可以采用一易筛选的已知的基因对第一拷贝进行替换，以达到使第一拷贝失活的效果，也可以采用其他已知的如基因置换、重组、或移码等手段对第一拷贝进行处理，只要能使其不被表达且不影响其他核苷酸序列表达即可；所述突变第二拷贝3′端60-150碱基对的方法也可以采用一易筛选的已知的基因替换第二拷贝的3′端60-150碱基对，或采用其他已知的如基因置换、重组、或移码等手段对其3′端60-150碱基对进行处理，只要能使第二拷贝能部分表达且维持部分木糖醇脱氢酶活性即可。

优选地，本发明采用抗潮霉素B基因来替换第一拷贝，筛选的标记是抗潮霉素B；采用乳清苷酸脱羧酶基因来替换第二拷贝3′端150碱基对，筛选的标记是尿嘧啶营养缺陷型。

根据以上方法得到的重组酵母菌株，其木糖醇脱氢酶活性大大降低，导致木糖醇降解速度减慢，致使木糖产量增加；同时还保证微量的木糖醇继续代谢维持酵母的存活，不必额外添加甘油作为碳源保证酵母细胞的存活，可广泛应用在发酵生产木糖醇中。