[发明专利]利用动物乳腺生物反应器生产人源化单克隆抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用动物乳腺生物反应器生产人源化单克隆抗体的方法。

背景技术

自1975年B淋巴细胞杂交瘤细胞融合技术问世以来，经过30多年的发展，单克隆抗体作为一类用于临床预防和治疗的药物，在医学治疗方面显示出愈加重要的作用。同时，快速发展的治疗性抗体市场也驱动单克隆抗体大范围的应用。2002年全球的单克隆抗体药物销售额到达54亿美元，2004年达103亿美元，估计到2010将达到303亿美元，将占到生物技术产业利润的32％。目前绝大多数商业化抗体都是通过哺乳动物细胞系进行表达的，但是用细胞表达抗体的产量有限(0.1-1克/升)，大规模的生产势必带来昂贵的生产成本。此外，后期的纯化工艺复杂，而且对于不同批次的生产抗体的表达水平及活性可能会有差异。之前，有研究人员通过重组杆状病毒-昆虫细胞表达系统生产针对甲肝病毒的抗体，最高表达量仅为18毫克/升(中国专利申请01110720.0)，而在CHO(中国仓鼠卵巢细胞)表达抗甲肝病毒的单克隆抗体，表达水平也仅为40-60毫克/升(中国专利申请200410070620.9)。这些生产能力的不足之处使得人们需要一种更高效的方法生产治疗性单克隆抗体以满足市场的紧迫需求。

随着分子生物学和遗传操作技术研究的发展，利用动物乳腺生物反应器低成本、大规模的表达单克隆抗体成为可能。这种方法具有低成本(是哺乳动物细胞培养技术的1/100-1/10)和高产量(1-20克/升)的特点，同时，具备复杂的翻译后修饰系统、持续分泌及稳定的生物学活性等优势。因此，动物乳腺生物反应器可以很好的替代哺乳动物细胞体系成为生产单克隆抗体的途径，即将乳腺表达载体转入哺乳动物基因组，获得转基因动物，从而在其乳腺中高效表达单克隆抗体等外源蛋白。2006年，首个利用山羊乳腺生物反应器生产纯化的重组人蛋白，抗凝血酶III被欧洲药监局批准作为治疗遗传性抗凝血酶缺乏症的疾病。2009年2月，美国FDA也批准了这个转基因动物表达的药物ATryn，这是第一个转基因动物生产的药物上市用于临床，标志着转基因动物药物真正迈入产业化阶段。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用动物乳腺生物反应器生产人源化单克隆抗体的方法。

本发明所提供的利用动物乳腺生物反应器生产人源化单克隆抗体的方法，是将5’末端带有引导序列的抗体重链编码基因和5’末端带有引导序列的抗体轻链编码基因导入哺乳动物细胞中，获得表达抗体的转基因细胞；以所述转基因细胞为核移植供体细胞，卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得的克隆胚胎；将所述的克隆胚胎通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得转基因家畜，利用所述转基因家畜生产人源化单克隆抗体；所述引导序列的核苷酸序列为序列表中的序列1。

其中，所述抗体可为抗人甲肝病毒抗体。所述哺乳动物细胞可为胎儿成纤维细胞。所述家畜可为牛或羊。

所述转基因细胞、所述克隆胚胎也属于本发明的保护范围。

本发明的利用动物乳腺生物反应器生产人源化单克隆抗体的方法利用转基因动物技术，其成本低，是哺乳动物细胞系培养技术的1/100-1/10；且利用乳腺生物反应器，其单克隆抗体产量高，以人源甲肝病毒单克隆抗体为例，其产量可达30克/升，具有重要的经济和社会价值。

附图说明

图1为人源抗体乳腺表达载体线性化酶切回收结构图。

图2为Western Blot检测转基因小鼠乳样中人源抗体表达情况。

图3为PCR检测双链整合的阳性转基因牛。

图4为特异性ELISA检测重组抗体对HAV抗原的结合活性。

图5为体外中和试验检测转基因奶样中重组抗体的结合特异性。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

以下实施例所使用的载体、菌种、试剂及其来源：

pBC1载体(Invitrogen)，pCI-neo载体(Promega)；

引物合成及序列测定由上海生工完成；

实验动物用昆明小白鼠，自北京实验动物中心；

Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶均为Biolabs公司产品；

Northern杂交膜均购自于美国Amersham biosciences公司；

HRP标记的抗人Fab IgG二抗购自sigma公司；

酶切、连接、回收、转化、PCR扩增、细胞培养、细胞转染等常规分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》；

甲肝病毒毒株及罗猴肾细胞系由中国疾病预防控制中心提供。