[发明专利]一种人MGF多肽及其抗体制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及以抗体为特征的体外试验用的生物制品，具体是一种特异的人MGF多肽及其抗体制备方法，属于生物医学技术领域。

背景技术

1999年，Goldspink等将兔子的胫前肌置于伸展固定状态后对其进行电刺激，7天后发现肌肉块增大了35％。采用差异显示技术，在那些处于拉伸状态并被电刺激的的肌纤维中，发现了大量能促使肌肉修复的IGF-1剪接异构体，命名为Mechano GrowthFactor(MGF)。国内学者一般将其翻译为机械生长因子、力生长因子、生长因子素等。MGF在快速促进受损伤肌肉修复再生、增加肌肉干细胞数量、保护神经等方面具有重要的生理作用。

人MGF基因序列与来自肝脏的IGF-1相比，是在其mRNA的5号外显子上插入了49个碱基，由于插入的碱基不能被3整除，所以产生了不同于IGF-1的表达产物。与全身性表达和发挥广泛生理功能的IGF-1不同，MGF多在机体受到机械刺激或局部肌肉/神经遭到损伤时，才会在损伤发生部位表达并发挥高效的修复和保护功能。在体内，通过模式动物证实，MGF在维持局部肌肉质量和组织修复过程中的作用效果也明显高于IGF-1。把含有MGF cDNA的表达载体注入老鼠胫骨前肌，仅在15天内肌肉质量就可增加20％，而携带IGF-1Ea cDNA的病毒载体注入后，则需120天肌肉质量才达到同等水平。表明MGF是肌肉修复过程中一种重要的功能分子，与肌肉再生所必需物质的表达之间存在着密切的内在联系。通过制备肌肉切片并测定肌纤维尺寸，发现肌纤维整体平均增加25％，但这种增加只局限于受注射部位，表明MGF的生理功能既具有作用效果的显著性，也具有很强的靶位点特异性。另外，Olesen等研究发现MGF还可诱导肌腱胶原蛋白的合成，在机械刺激后表达迅速上调的MGF与胶原蛋白III的mRNA合成速率正相关。另外，MGF还具有很强的神经保护作用。在蒙古沙鼠的短暂脑缺血模型中，Dluzniewska等通过注射MGF合成肽能够赋予沙鼠显著的神经保护作用；在抵抗脑部缺血的海马体内检测到了表达明显上调的MGF蛋白，而且这种作用是不依赖于IGF-1的受体而独立发挥。Goldspink等研究了MGF对面神经切断术后的修复损伤作用，发现相距3毫米的神经创面仅在两周内就得到完全愈合，明显优于IGF-1 Ea和其他分子。数据显示，MGF对运动神经元的保护效果达到了80％以上。目前为止，未见介绍通过合成多肽进行抗人MGF多克隆抗体制备的文献报道。

发明内容

本发明是为解决通过免疫实验特异性检测人MGF的表达与天然存在，并建立相应体外免疫分析所需基本生物制品的问题，而提供的一种能特异性针对人MGF的合成多肽抗体及其制备方法。

本发明所述的抗人MGF合成多肽抗体，按照以下步骤制备：

抗原表位分析与拮抗位置确定：利用经典的表位预测软件DNAstar进行综合分析，主要考量指标包括亲水性结构、抗原指数、表面可及性等，最终确定第76到第88位为该抗体的靶标，其氨基酸序列为QRHTDMPKTQKYQ。

多肽的合成：靶标多肽采用全自动多通道多肽合成仪合成，柱层析纯化，然后通过HPLC，用每分钟1％的标准乙晴梯度来检测纯度。

多肽与载体蛋白交联：由于本合成多肽分子量太小，在动物体内不能诱导产生免疫反应，因此将多肽与载体蛋白交联后才能进行免疫，选择钥孔嘁血蓝素进行交联，能显著增加抗原的免疫原性，从而制备出人工免疫原。

免疫动物：所述的制备方法，其抗原肽-交联载体蛋白做为免疫原，免疫家兔制备抗体。选取适龄免疫用新西兰兔，经过适应性饲养后进行多点注射免疫。反复加强免疫，至取血测抗体效价达到标准时停止免疫。

抗体纯化：达到要求的免疫动物放血，标准方法收集抗血清，依次使用辛酸-硫酸铵方法和亲和层析过柱纯化方法，进行抗血清纯化，通过SDS-PAGE和HPLC验证纯度，得到目标抗体。

本发明制备的高质量多肽抗体效价高、亲和力强，可与天然人MGF分子发生特异性结合反应。用多肽制备抗体的成本较常规的重组抗原制备抗体方法低，抗体特异性好，经亲和层析纯化后可以用于各种酶免检测和WB试验要求，可用于建立体外免疫分析。该合成肽抗体的制备，为人MGF分子的研究及其相关疾病的研究提供了一个重要工具，以及在生物医学研究中对相应靶蛋白的特性、含量的测定、分布情况的分析和蛋白的确证等方面都具有重要作用。

附图说明

图1是DNASTAR软件分析图，表明本发明所选择的肽段位于该蛋白的抗原性和亲水性较强区段。