[发明专利]切割耶尔森氏鼠疫杆菌F1抗原的方法及相关应用

说明书

本发明基于以下受资助的课题：

国家高技术研究计划项目：《鼠疫特异性诊断新技术的建立及应用评 价》，项目编号：2006AA2Z4A7。

技术领域

本发明涉及一种切割耶尔森氏鼠疫杆菌F1抗原的方法及相关应用，具 体还涉及一种分析蛋白A(如F1抗原)抗体阳性样品与蛋白A线性表位反 应性的方法。

背景技术

鼠疫(Plague)是由耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia pestis)引起的自然疫 源性烈性传染病，是一个古老却迄今仍严重威胁人类的传染病，其席卷全 球的三次大流行，夺走了数亿人们的生命。近年来，世界鼠疫疫情呈上升 趋势，世界卫生组织已将鼠疫列为重新抬头的传染病，因此鼠疫的威胁依 然存在，一旦暴发，那将是人类的灾难。

鼠疫免疫检测是鼠疫防治工作中的一个重要环节，其在鼠疫的发现、 疫区处理及临床诊断中发挥至关重要的作用。回顾鼠疫免疫检测的历史， 主线是围绕F1抗原的历史。F1抗原是由耶尔森氏鼠疫杆菌pMT1质粒上 caf1基因编码的一种荚膜蛋白，自然状态下以单体及聚合体形式存在，其 单体分子量约为15.5kD，具体氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示(EMBL 号：P26948[22-170])。

长期以来，F1抗原被认为是鼠疫杆菌的特异性抗原，基于F1的检测抗 体的方法被认为是较可信的鼠疫检测和诊断方法。然而，2003年，在某些 自然人群中发现3％左右的F1抗体阳性者，其中最高滴度的F1抗体为1∶ 2560，对以F1抗原为基础的检测鼠疫抗体的方法提出了挑战。自然人群血 清F1抗体阳性问题是长期困扰鼠疫领域的一难点问题，当前对这一问题的 探讨只是在理论方面的一些猜想，一种观点认为是鼠疫疫苗的残余效价； 一种观点认为是针对鼠疫F1抗原的位点交叉引起的；也有观点认为是鼠疫 弱毒株感染所致。然而，由于受当前技术的限制，比如，在当前寻找确定 样品中抗体是针对抗原分子哪个或哪些位点的研究方法中，通过化学合成 多肽及克隆表达多肽的方法是较为通用的方法，但这些方法往往需要对蛋 白全长进行重叠步进式设计，工作量比较大，而且常常由于步进距离的不 合理，漏掉一些位点甚至找不出反应性位点；采用蛋白酶解或切割蛋白并 结合片段分离技术、质谱鉴定等技术来寻找并确定反应性位点也是用来分 析表位的方法，但该方法往往在分析蛋白的自身组成后，难以确定具体切 割方案并找到合适的切割试剂，从而限制了其应用，目前利用实质性的方 法去解释、验证自然人群血清F1抗体阳性问题并没有进展。

自然人群中检测到高滴度F1抗体的现象中，是与F1抗原的位点交叉 反应，还是真正针对F1抗原的反应，解决这一疑问成为解释自然人群F1 抗体阳性问题的重要环节，而这一解释直接关系到鼠疫防治工作的策略制 定。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种切割F1抗原的方法，以用于进一步分 析解释上述自然人群血清F1抗体阳性问题。

本发明的另一目的在于提供一种分析F1抗体阳性样品与F1抗原线性 表位反应性的方法。

本发明的另一目的在于建立一种分析蛋白A抗体阳性样品与蛋白A线 性表位反应性的方法。

Leenu Sabhnani等人(参见Identification of immunodominant epitope of F1 antigen of Yersinia pestis.FEMS Immunol Med Microbiol.2000 Feb；27(2)： 155-62)通过亲水性、分子表面可及性指数、可塑性、抗原性及两性氨基酸 构成等指标综合分析推测，F1抗原上至少存在5个线性表位，分别位于如 SEQ ID NO：1所示F1抗原氨基酸序列的第75～85位、第84～102位、第 102～116位、第116～128位、第121～144位；并通过实验证实，表位第121～144 位可以与高稀释的F1抗血清起反应，表位102～116位有较高的免疫原性， 可以刺激机体产生较高效价抗体。也有学者认为第75～85位是最主要的B 细胞表位(参见Zav′yalov V，Denesyuk A，Zav′yalova G，et al.Molecular modeling of the steric structure of the envelope F1 antigen of Yersinia pestis. Immunol Lett，1995，45：19～22.)。