[发明专利]生物反应器微载体培养动物细胞生产猪瘟疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及培养细胞生产疫苗的方法，特别是涉及一种生物反应器微载体培养动物细胞生产猪瘟疫苗的方法。

背景技术

猪瘟(HC)是由猪瘟病毒(Hog cholera virus，HCV)引起的猪的一种高度传染性疾病，它流行广泛，发病率、死亡率高，给养猪业造成了严重的经济损失。现有预防和控制猪瘟的最有效的方法是接种猪瘟疫苗

现用于猪瘟病毒培养的细胞载体主要有牛睾丸原代细胞(BT细胞)、猪肾细胞(PK细胞)、猪睾丸细胞(ST细胞)等。由于我国牛群较普遍存在BVD/MBV病，用牛睾丸细胞原代细胞制苗，易造成细胞外源病毒污染，且产毒滴度不高，批间差异大，给疫苗产量、效力的提高带来困难。而且牛睾丸细胞为原代细胞，细胞的寿命有限，每次制苗需重新获得细胞。而猪肾细胞、猪睾丸细胞为连续传代细胞系，取材容易易于放大进行规模化培养，有逐渐取代牛睾丸细胞生产猪瘟疫苗的趋势。非专利文献1表明PK、ST、MPK细胞对猪瘟病毒敏感，多种猪瘟病毒疫苗株在猪肾细胞或猪睾丸细胞上适应而得到疫苗株。

现有的猪肾细胞、猪睾丸细胞规模化生产工艺为转瓶(roller bottle)培养，细胞扩增较为缓慢，且过程条件不均一，批间差较大，同样也存在产毒滴度较低的问题。生产规模放大的方式为增加转瓶数量、扩建厂房、添购重复设备等，而且培养过程对pH、溶氧、营养物补加等不可定量监控，过程较粗放。同时由于所需转瓶较多，存在易污染的机会。

另外由于转瓶的特性，使其培养方式只能为批培养，单位体积细胞数量较少，单次培养细胞产物较少。专利文献1公开了一种细胞系生产猪瘟活疫苗的方法，但是其所用生产方法为传统的转瓶培养，对生产疫苗的产量和质量仍有一定的限制。将生物反应器技术结合微载体技术应用到宿主细胞培养上，通过接种猪瘟病毒毒株进行病毒培养和收获，并用于制备疫苗的生产工艺还未见报道。

专利文献1：CN 101181637A

非专利文献1：猪瘟病毒及其疫苗研究进展，中国病毒学，第11卷第3期第201～207页，1996年9月

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用大规模生物反应器培养动物细胞生产猪瘟疫苗方法。该方法可解决现工业大规模转瓶培养效率低下，规模放大粗放，单位体积动物细胞数量较少的问题，进行集约生产。同时由于生物反应器各连接管路均为密闭管道，可减少污染的发生，易于控制产品的批间质量，还可优化培养方式，使用特殊的培养策略-灌注培养模式进行细胞培养，使细胞时刻处于最佳生长状态。

本发明提供一种大规模生物反应器微载体培养动物细胞生产猪瘟疫苗的方法，其包括以下步骤：

1)用转瓶或小规模反应器微载体扩增培养动物细胞并制成细胞悬液；

2)在大规模反应器的微载体上接种由步骤1)生产的细胞悬液并进行培养；

3)将猪瘟疫病毒接种于上述步骤2)的大规模反应器微载体上的细胞并进行繁殖；

4)收获病毒液，生产猪瘟疫苗。

其中，所述小规模反应器的体积为10L以下，所述大规模反应器的体积为100～1000L。

本发明具有如下有益效果：

1.细胞培养、病毒复制采用的设备为生物反应器，可对培养过程进行监控及定量控制，生产工艺稳定，同时结合细胞的贴附载体-微载体，并采用优化的灌注培养系统及方法，可实现细胞的悬浮培养，提高单位体积细胞的数量，从而提高病毒的产毒量。

2.采用本发明培养的猪瘟细胞毒液病毒含量高，提高单位生产效率，并且使用高滴度抗原制造的猪瘟疫苗可大大提高疫苗的免疫效力。产品效力及安全性与转瓶培养相当或优于转瓶培养。

附图说明

图1是表示反应器微载体培养猪睾丸细胞生长曲线的图；

图2是反应器微载体培养猪睾丸细胞的细胞照片。

具体实施方式

本发明提供一种大规模生物反应器微载体培养动物细胞生产猪瘟疫苗的方法，其包括以下步骤：

1)用转瓶或小规模反应器微载体扩增培养动物细胞并制成细胞悬液；

2)在大规模反应器的微载体上接种由步骤1)生产的细胞悬液并进行培养；

3)将猪瘟疫病毒接种于上述步骤2)的大规模反应器微载体上的细胞并进行繁殖；

4)收获病毒液，生产猪瘟疫苗。

其中，所述小规模反应器的体积为10L以下，所述大规模反应器的体积为100～1000L。