[发明专利]一种新的检测血清样本中鼠疫抗体的方法和产品

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的检测血清样本中鼠疫抗体的定量检测方法和产品及其制备方法。

背景技术

鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)属于耶尔森菌属(Yersina)，是引起烈性传染病鼠疫(Plague)的病原菌。鼠疫是一种病情凶险的传染病，传染性强，致死率为30％至100％，鼠疫的潜伏期大约是2至7天，各型的初期症状有发高烧、剧烈头痛、呕吐、脸部潮红、眼红、皮肤有出血点、意识模糊、四肢剧痛、局部淋巴结肿大等等。

免疫学方法酶联免疫实验(ELISA)中利用抗原与抗体特异性反应来检测抗原或抗体主要有由双抗原夹心测抗体、双抗体夹心测抗原、竞争法、间接法等。间接法测抗体的原理是特异性抗原结合到固相载体上，然后和待检血清中的相应抗体结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体与免疫复合物中的抗体结合形成酶标记抗体-抗体-固相抗原复合物，加底物显色，判断抗体含量。

悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片，是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。

目前发展的悬浮芯片主要是基于细胞因子的检测。但是悬浮芯片是否能够检测人血清中的鼠疫抗体，尚缺乏模型和评价。

发明内容

本发明涉及一种新的检测血清中鼠疫抗体的蛋白悬浮芯片，该芯片包括：编码微球，作为包被微球抗原的鼠疫F1抗原，生物素标记的羊抗兔IgG和羊抗人IgG作为检测抗体，链亲和素-藻红蛋白和适宜的缓冲溶液。

本发明提供上述检测鼠疫抗体的蛋白悬浮芯片的制备方法，其特征在于，在相关缓冲溶液中，编码微球用鼠疫F1抗原包被、用生物素标记的检测抗体为羊抗兔IgG、羊抗人IgG、用链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)作为信号检测物。

本发明提供一种鼠疫抗体的蛋白悬浮芯片定量检测方法，该方法采用间接法检测抗体的免疫学检测原理，其特征在于，在检测过程中所有反应可在96孔滤板上或在微量离心管中进行，其中包括下列步骤：(1)每孔或管中加入含有已包被捕获抗原，即鼠疫F1抗原包被的编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入待测血清样品，孵育后清洗；(3)加入生物素化的检测抗体，孵育后清洗；(4)加入链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)，孵育后清洗，(5)加入检测缓冲液后混匀，(6)用悬浮芯片系统读取MFI数值(即平均荧光强度)并分析数据判定检测结果阴性或阳性。

本发明还提供一种检测血清样品中鼠疫抗体的蛋白悬浮芯片定量检测方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：(1)加入的阳性检测样品或标准品经4倍梯度倍比系列稀释，(2)制作样品浓度对应MFI值的剂量-反应标准曲线，(3)用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程，(4)根据剂量-反应曲线可判断动态检测范围、未知浓度样品可根据剂量-反应方程计算出检测样品的浓度，还可判定方法的检测限。

悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.6μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。悬浮芯片技术由于利用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。

本发明人经过大量和深入的研究，对鼠疫抗体的蛋白悬浮芯片制备及其检测条件作了实质性的改进和创新，其具有下列优点：

1、抗原包被量的改进