[发明专利]抗阿尔茨海默病单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种新型抗阿尔茨海默病单克隆抗体。本发明还涉及所述单克隆抗体在制 备阿尔茨海默病的诊断试剂和治疗药物中的应用。

背景技术：

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，以下简称AD)是全世界60岁以上老年人痴呆 的最主要原因。AD的早期诊断、预防和治疗具有重大意义。自1975年Kohler和Milstein 创建B淋巴细胞杂交瘤技术以来，各种单克隆抗体相继出现，用于疾病诊断治疗的基础与 临床研究，发挥了重大作用。

已知Aβ寡聚体是引起AD早期病理和学习记忆行为改变的主要原因。1999年Schenk 等用Aβ42分子为多肽疫苗免疫PDAPP转基因小鼠，经过治疗，幼年小鼠脑内没有产生β- 淀粉样斑块沉积、神经细胞萎缩等AD的典型病变。已经发病的老龄鼠，治疗后病变明显 减轻。2001年人工合成的Aβ1-42疫苗(AN1792)进行了临床IIa期实验。不幸的是在接 受治疗的患者中有6％出现了脑膜炎。由于治疗可能存在的副作用，该疗法在2002年的1 月被全面停止。临床结果显示，在接受治疗一年后，体内产生针对Aβ斑块抗体的患者与 没有产生抗体的患者相比，认知能力下降速度减慢。患者的尸检结果显示在大脑皮层中没 有或只有少量的Aβ斑块，在斑块消失部位发现反应性小胶质细胞，同时发现有IgG结合 到斑块上。

从此以后，众多学者开始采用针对Aβ分子的免疫疗法来治疗或预防AD，取得了不同 程度的疗效。但现有技术的免疫方式及效果仍不够理想，尤其是不能特异性识别特定的Aβ 寡聚体。在免疫治疗实验中，有可能与纤维结合，发生脑出血等副反应。

因此，研制特异性识别和结合Aβ寡聚体的单克隆抗体，确有必要。

发明内容：

本发明的目的是提供一种抗阿尔茨海默病单克隆抗体，直接目的是提供抗人Aβ单克 隆抗体，能够特异性识别和结合Aβ寡聚体，可用于制备阿尔茨海默病的诊断试剂和治疗 药物。本发明制备了寡聚体高亲和性抗人Aβ单克隆抗体，取名为A8。

本发明人使用5’RACE的方法克隆到Aβ寡聚体高亲和性单抗A8轻链、重链可变区 基因。根据抗体恒定区CH-1区的最保守的一段序列设计引物，进行反转录，在cDNA产 物的5’端加上Poly(C)尾巴，然后使用针对多聚脱氧核苷酸尾巴设计的锚定引物与基因特 异性引物通过PCR方法将目的基因扩增出来。序列分析表明，A8抗体轻链和重链可变区 序列与已经提交的小鼠IgG可变区序列同源性达90％与92％。可以确定所得到的序列为 抗体轻链和重链可变区序列，而非其它基因的序列。所得VH和VL基因可编码正确的小 鼠抗体可变区。

A8重链和轻链可变区基因是从能够分泌较高活性的鼠源性寡聚体高亲和性抗Aβ单抗 的杂交瘤细胞株中克隆的。其中所述的重链可变区基因全长为450bp，所述的轻链可变区 基因全长为429bp，两个基因重组后可用于表达特异性识别和结合Aβ寡聚体的抗体活性 片段。

抗Aβ寡聚体单抗A8轻、重链可变区基因的克隆。

分泌产生上述抗阿尔茨海默病单克隆抗体的细胞株为北京交通大学生命科学与生物 工程研究院采用传统的骨髓瘤与脾细胞融合的方法获得的一株Aβ寡聚体高亲和性的鼠源 性抗人Aβ单抗杂交瘤细胞株，命名为A8，其抗原为Aβ1-42聚集物，其分泌的抗体分子 亚型为IgG3。

所述A8杂交瘤细胞已经在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏。

所述抗人Aβ单克隆抗体A8的重链与轻链可变区如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所 示。其中：

SEQ ID NO：1是抗人Aβ单克隆抗体重链可变区DNA序列；

SEQ ID NO：2是抗人Aβ单克隆抗体重链可变区氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是抗人Aβ单克隆抗体轻链可变区DNA序列；

SEQ ID NO：4是抗人Aβ单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列。

本发明在制备抗人Aβ单克隆抗体及其性质和功能鉴定中进行了如下实验：

1、抗原制备及抗体性质的鉴定

Aβ寡聚混合物(即本发明所用的免疫抗原)的制备(见实施例1，“1.Aβ寡聚混合物 的制备”)。其亚类为IgG₃，抗原识别表位在Aβ多肽N端1-6位氨基酸。