[发明专利]荧光标记大麻性别基因特异片段检验系统及方法

说明书

技术领域：

本发明涉及基因特异片段检验系统及方法，具体涉及大麻性别基因特异片段检验系统及方法。

背景技术：

大麻是一种古老的栽培植物，是世界上许多国家重要的经济作物，但因其含有毒性成分——四氢大麻酚(THC)和大麻二醇(CBD)，已被联合国禁毒公约列为毒品。大麻为雌雄异株植物，雄性植株中不含THC和CBD或含量很少，雌性植株二者含量则相对较高，因此认为雌性植株具有药用价值和作为毒品的滥用潜力。然而大麻雌雄植株在幼苗时期难以区分，只有当植株开花后才能辨认，从而错过了铲除毒品原植物的最佳时期。因此大麻性别的鉴别、特别是早期鉴别对于打击毒品犯罪具有重大意义。

随着科学技术的发展，大麻性别检验技术也在飞速发展，早期是通过大麻外部形态及生理生化特征的差异鉴别大麻性别，相继发展到由细胞水平的差异和目前在DNA分子水平上研究大麻性别。从上世纪90年代至本世纪初国内外学者用扩增片段长度多态性(AFLP)或随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对大麻性别进行鉴定，找到了相应的大麻性别的AFLP标记和RAPD标记并进行了序列测定或转化为可靠性稳定性更好的SCAR(sequence characterized amplified regions)标记。这些DNA分子标记技术应用于雌雄异株植物的性别鉴别，相对于形态及生理生化特征的鉴别提高了鉴别结果的准确性和可靠性。

RAPD标记技术是Williams等(1990)提出的，其原理是用含有10个碱基随机序列组成的寡核苷酸做引物，通过PCR扩增获得长度不同的多态性DNA片段。它具有设计引物无须知道序列信息，不需要DNA探针，合成一套引物，可用于不同生物，技术简便，成本较低等优点。由于这些优点，使该技术在动植物及人类基因定位和作图研究中都得到了广泛的应用。如在大麻性别研究中Sakamoto等(1995)用15个随机引物扩增得到一条700bp的雄性特异带；Hong Shao等(2003)用15个随机引物对大麻雌雄株进行了RAPD分子标记，其中有一个引物扩增出雌株特异条带，找到了与雌性相关的特异标记。但RAPD标记技术的实验重复性差，每个标记提供的信息量少，不能鉴别杂合子和纯合子，检测受反应条件的影响较大，结果可靠性低。

AFLP标记技术是由Zabeau和Vos于1993年创立的，该技术结合了RFLP技术和RAPD技术的特点，使用人工接头(adaptor)与基因组DNA限制性内切酶酶切片段连接并以此为DNA模板，合成系列3’一末端，随机变化三个碱基且与人工接头系列互补PCR引物进行特异条件扩增，通过变性PAGE电泳检测后可获得多态性图谱，AFLP技术革新是继RFLP、SSR和RAPD之后近几年来，发展最快的DNA分子标记技术，在农业、林业、畜牧业、渔业、医学等生命科学领域中正得到广泛应用。如在大麻性别研究中Giuseppe等(2002)对雄和雌的BSA(bulked segregant analysis)进行AFLP分析，表明大麻雄性染色体的存在。V.M.Cristiana Moliternil(2004)利用意大利的雌雄异株栽培种大麻品种Fibranova，对大麻的性别差异进行了形态学及分子生物学研究。但AFLP技术需进行酶切位点和构建人工接头等，前期技术建立较复杂。

SCAR分子标记是1993年由Paran和Michelmore提出的基于PCR技术的单基因位点多态性遗传标记，SCAR分子标记是在序列未知的DNA标记(RAPD，AFLP等)基础上，对其特异产物进行回收、克隆和测序，根据扩增产物的碱基序列重新设计特异引物，并以此引物对基因组DNA进行PCR扩增获得。新的SCAR引物一般是在原来标记引物的基础上延长了10个左右碱基，不仅加强了与模板的特异性结合，而且提高了退火温度，提高了转化后新标记检测的专一性。SCAR具有已知序列，标记共显性且简单易用、重复性好等优点。如Otto等(2002)利用20条RAPD引物对雌雄异株和雌雄同株大麻栽培种进行分子标记，其中有2个引物产生了与雄性植株的特异带。将这两条带进行了分离、克隆和测序，并转换为了SCAR标记，通过F2检测这两个标记与雄性表现型紧密连锁，通过F2的遗传分析确定它们在Y染色体上。