[发明专利]重组融合蛋白介导的牛分枝杆菌感染检测试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域。本发明涉及用于牛分支杆菌感染检测的试剂盒及方法。

背景技术

牛结核病是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一种人畜共患慢性消耗性传染病，人和动物交叉感染造成该病广泛流行， 因此具有非常重要的公共卫生意义。世界卫生组织(WHO)指出：“在存在牛结核病的国家， 人类始终受到威胁，除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的。”目前，一些 较发达国家和地区，如美国、澳大利亚和北欧等已基本消灭了牛结核病。但牛结核病在我国 依然是最常见的多发性疾病之一，1985年和1987年两次全国奶牛抽样调查结果显示，牛结 核病的患病率分别达5.83％和5.43％。近年来，随着个体养牛户的增加，结核病的阳性检出 率正逐年上升。目前我国一些省区牛结核病的发病率已达9％，甚至更高。

目前，牛结核病的世界动物卫生组织(OIE)法定检验方法为牛分枝杆菌纯化蛋白衍生 物(purified protein derivatives，PPD)皮内变态反应试验(GB/T 18646)，该试验存在主观性 强、耗时、耗力、短时间内不能进行重复检测、特异性差、近期受感染牛体敏感性很低等方 面的缺点。

为了提高牛分枝杆菌检测特异性，国内外学者开始利用基因重组技术，重组表达了牛分 枝杆菌的多种蛋白，例如6kDa早期分泌性抗原性靶(The early secreted antigenic target 6ku protein ESAT-6)、MPB64、MPB70、MPB63、热休克蛋白65(Heat shock protein 65，HSP65)、 抗原85B(antigen 85B，Ag85B)、10kDa的培养滤液抗原(10kDa culture filtrate antigen，CFP10) 等。然后，用这些重组蛋白中的一种或者多种混合(又称“鸡尾酒法”)作为包被抗原进行酶 联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测，通过检测牛血清中相应 的抗体水平进行牛结核病的血清学诊断，该方法虽然一定程度上提高了检测的特异性，但其 敏感性不够理想。

90年代后期国外发展起来的以PPD为抗原的γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)释放试验明显 提高了牛分枝杆菌感染检测的灵敏性，其原理为：致敏的外周血淋巴细胞在体外培养过程中， 通过特异抗原(如PPD)刺激后被活化，从而高水平表达并分泌IFN-γ，通过相应的技术手段 对培养上清中IFN-γ的释放水平进行检测(如ELISA)从而判断其是否感染，其结果与淋巴细 胞增生试验具有很好的相关性。该方法避免了对机体的侵入性实验，可以短时间内多次重复 检测，同时也摒弃了结核菌素试验中操作和判断上的主观性，因此具有非常广泛的应用前景， 目前国外已将该类牛结核病诊断试剂盒商品化。但由于PPD包含的抗原成分复杂，其中部分 抗原在牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、禽分枝杆菌及非致病性环境分枝杆菌中均广泛存在，致 使其特异性较差，在实际使用过程中常常出现假阳性。

因此，亟需开发一种能同时提高检测的特异性和敏感性的检测试剂和方法，既能克服血 清学检测方法敏感度不高的缺陷，又较PPD刺激IFN-γ释放试验具有更高的特异性。

本发明通过大量实验，用多基因串联重组表达的融合蛋白替代PPD，作为IFN-γ释放试验 的刺激原，提高了实验特异性的同时，也克服了单一抗原或“多抗原鸡尾酒”血清学检测敏感 度不高的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供用于牛分枝杆菌感染检测的试剂及方法。