[发明专利]疟疾重组抗原、IgY抗体及疟疾检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的疟疾重组抗原。具体而言，本发明涉及一种新的疟疾抗原，通过该抗原免疫鸡获得的IgY抗体，以及含有该IgY抗体的检测疟疾感染的试剂盒。

背景技术

疟疾位居全球最严重的三大传染病之一，威胁近40亿居住在热带及亚热带地区人口的健康。其中恶性疟疾每年感染3-5亿人，夺去数百万人的生命。疟疾也因此严重阻碍了发展中国家的经济增长。由于疟疾治疗药物的特殊性，精确快速的诊断不仅能及时发现并治疗疟疾患者，大大降低病死率，也能通过早期排除疟疾，及时挽救感染了其它传染性疾病患者的生命。与此同时，精确快速的早期诊断也是对疟疾进行实时流行病学监测和控制的必要手段。目前诊断疟疾的经典方法仍为血涂片显微镜检法，该方法对检验者的技能和经验要求很高，远远无法满足非洲和南美洲国家中绝大多数生活在偏远地区患者的需要，造成大量患者因延误诊治而死亡。此外，用于疟疾早期诊断疟疾抗原的方法为双抗体夹心法和PCR方法。其中，基于单克隆抗体的双抗体夹心法近年来受到越来越多的关注，它们主要应用三类单克隆抗体：1，抗HRP-II抗体；2，抗pLDH抗体；3，抗Aldolase抗体。迄今为止，现有的该类方法存在的主要问题是：1)敏感性低：由于单克隆抗体只能识别单个表位和抗原，因此敏感性低于血涂片显微镜检法：在82％-95.2％之间，最低的仅有57％，尤其当虫血率低于0.01％时，敏感性明显下降至50％；2)特异性低：由于受到流行区虫株间差异和变异的影响，仍不够理想：一般在93％左右，最低的仅有76.9％；3)交叉反应：单克隆抗体的使用易与类风湿因子、异嗜性抗体、抗核抗体有交叉反应；检测的假阳性率较高；4)半衰期短：大多数商品化的快速检测试剂盒要求在2-30℃存放，但真正在疫区使用时这一条件难以保证；理想的试剂盒应能在40-50℃高温下保存两年；5)成本高：尤其是单克隆抗体的研发和生产成本很难再大幅度降低，这对于疟疾泛滥的发展中国家人民仍然难以接受。因此，建立一套稳定、敏感和廉价的诊断方法成为全球疟疾防治亟待解决的重要问题。

鸡卵黄抗体——IgY被越来越多的应用在疾病诊断、预防、治疗，食品科学和兽医科学等领域，被认为是除哺乳动物外产生多克隆抗体最佳抗体来源。

由于禽类与哺乳动物远源，因此不仅可针对许多哺乳动物中高度保守的抗原产生免疫反应，而且能针对更多的表位产生抗体。

现有技术披露IgY抗体也不与类风湿因子和其它IgG分子反应，避免了免疫分析中的假阳性结果并且降低实验背景。IgY抗体对酸、碱、热、蛋白酶的耐受性很高，适合疟疾疫区的环境特点。

经收集鸡蛋生产IgY的方法既方便又快捷，并且目前已建立了高效、经济、可自动化控制的IgY纯化技术，适合大规模生产应用。这些优点均可成为提高检测灵敏性、降低成本、解决上述疟疾诊断问题的关键因素。

现有技术中未有在疟疾免疫诊断中使用IgY的报道，尤其是使用本发明的抗原获得的特异性IgY抗体在疟疾免疫诊断中应用未见报道。

发明内容

本发明从已证实的恶性疟疾特异性表位结合疟疾基因组数据库，经在线分析和软件预测出来自五个疟疾主要抗原的9个表位，将其连接，从而设计出一种新的人工重组抗原。采用该重组抗原免疫产蛋鸡，从免疫鸡卵中提取得到能够识别疟原虫多个靶向位点的特异性IgY抗体。再将此抗体标记辣根过氧化物酶(HRP)，最终建立双抗体夹心检测疟疾的方法。

本发明一方面提供一种疟疾重组抗原，其具有SEQ ID No：11所示的氨基酸序列。

本发明另一方面提供一种编码SEQ ID No：11所示的氨基酸序列的多核苷酸。由于密码子的简并性，所述多核苷酸可具有多种碱基序列。例如，为了在宿主细胞中(如大肠杆菌E.coli)表达，可使用该宿主偏好的密码子以提高表达效率。优选地，该多核苷酸具有SEQ ID No：10所示的碱基序列。

本发明又一方面提供一种通过本发明的抗原免疫鸡获得的特异性IgY抗体。

本发明又一方面提供本发明特异性IgY抗体在制备检测疟疾的制剂中的用途。由于本发明特异性IgY可有效识别疟原虫，因此可用于制备各种检测疟疾的试剂。

本发明又一方面提供含本发明特异性IgY抗体的试剂盒，优选地，该试剂盒使用ELISA法。该试剂盒可包括本发明特异性IgY抗体包被的酶联反应板、辣根过氧化物酶标记的IgY抗体和显色系统。所述试剂盒可通过本领域公知的方法制备，也可包括现有技术中其他可有效提高ELISA试剂盒灵敏度和特异性的辅助成分。

本发明又一方面提供一种制备本发明特异性IgY抗体的方法，所述的方法包括：