[发明专利]一种检测类鼻疽的基因液相芯片及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测类鼻疽(Burkholderia pseudomallei，B.p)的基因液相 芯片及其制备方法。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行检测的 方法。

背景技术

液相芯片检测是近几年发展起来的新兴技术，具有快速、特异、敏 感的特点。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的 微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜 色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.5μm，可依不同研究 目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据 不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。

类鼻疽菌为革兰阴性，双极，需氧，有动力，棒状无芽孢杆菌。类 鼻疽菌引起热带和亚热带地区人和动物的类鼻疽病，感染人可通过过呼 吸道、皮肤等多途径进入人体内，潜伏期一般为3～5天，少数也有数年 后发病，即所谓“潜伏型类鼻疽”，甚至20年以上。本病有急性败血症 型、亚急性、慢性及亚临床型3种表现，临床症状不典型，不易诊断。 亚急性或慢性类鼻疽典型表现是类似结核病的肺叶空洞，急性败血症患 者常伴多处化脓性损害，病情一般较为严重，如不及时治疗，病死率很 高。

应用传统的培养、生化鉴定的方法对类鼻疽做出诊断通常需要1周的 时间才能获得结果，且往往导致鉴定错误。利用直接免疫荧光、胶乳凝 集、ELISA等免疫学方法对培养物或标本中的抗原、外毒素等进行检测特 异性和敏感性都较好。分子生物学方法检测类鼻疽菌已见诸多报道。

发明内容

本发明涉及一种改进的基因液相芯片及其制备方法，该基因液相芯 片可以用于病原体类鼻疽的检测。本发明还涉及利用所述的基因液相芯 片进行检测的方法。

经过深入和大量的研究和实验，本发明以类鼻疽染色体标识序列为 靶序列，建立了类鼻疽的基因液相芯片和检测方法，为该菌的检测提供 一条可行的途径。

本发明所述的基因液相芯片包括：微球、捕获探针、引物、PCR反 应体系、链亲和素-藻红蛋白，该基因液相芯片可检测类鼻疽。

本发明还涉及上述可检测类鼻疽的基因液相芯片，该芯片包括：荧 光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链亲和素-藻红蛋白。

本发明的PCR反应体系包括：10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚 合酶。

本发明的引物包括：

其中，下游引物是5’生物素标记的Bp-R。

具体例如是Bp-R：5’-生物素-CCCCAGTTCATCTGATACTTGC

本发明的捕获探针，所述的捕获探针具有特异性：

  探针   名称   探针靶位   探针序列(5’-3’)   Bp   类鼻疽染色体标识序列   209-231bp   AGGTCAATTTCCCGAACAAGACT

本发明中，上面所述捕获探针在合成时在5’端进行氨基修饰，并且 连接15-20个T或连接C12作为间隔链，然后将探针与所选的编码微球 进行偶联。

本发明的微球，一般选择荧光编码的微球，例如来源于Luminex或 其他代理公司的任何编号的微球，特异性探针与荧光编码微球偶联形成 检测微球，由此构成检测芯片。