[发明专利]一种信号肽及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种信号肽及其编码基因与应用。

背景技术

由于核糖核酸酶抑制剂的存在，细胞中的核糖核酸酶降解RNA的水平不会影响 细胞的生存；然而，近年来越来越多具有细胞毒性的核糖核酸酶被发现，包括 Angrogenin、牛精液核糖核酸酶等。

Onconase(以下简称ONC)，中文译名为豹蛙酶，最早分离自Ranapipiens(北 极豹蛙)的卵母细胞和早期胚胎，属于核糖核酸酶A超家族(RNase A)。1988年 Mikulski等发现纯化的蛋白质(p-30)及其粗提物(Pannon)体外能有效地抑制人 白血病细胞株HL-60、人下颚癌细胞株A-253和人腺癌细胞株Colo 320 CM等的生 长及杀死这些细胞，并显示出时间-剂量依赖效应，同时体内试验进一步证明了其 抗肿瘤活性。1991年Aldelt等测出了它的全序列，并根据oncology和ribonuclease 将其命名为Onconase。1994年Merlino等用X射线对其三维结构做了准确的 描述。1999年Eugenio等成功地在大肠杆菌系统中表达并纯化了ONC重组蛋白，其 结构和性质类似于天然蛋白质。从1996到2004年Alfacell公司相继开展了ONC 对乳腺癌、胰腺癌、肾癌、非小细胞肺癌、恶性间皮瘤等临床研究，其中对恶性间 皮瘤疗效显著，且副作用小。2003年开始ONC与阿霉素共同治疗恶性间皮瘤的III期 临床研究。

ONC在细胞内具有良好的稳定性，药物体内半衰期为3h，溶解温度(Tm)值为 90℃，与核糖核酸酶抑制剂结合抑制常数(Ki)值约为1×10^-6，是细胞毒性的重要 原因。作为RNase A家族的最小成员，ONC由104个氨基酸构成，含有一个N糖基 化位点(-N69-V70-T71-)，天然的ONC是非糖基化形式的。分子内4对半胱氨酸 形成的4个二硫键构成其基本骨架。C-末端cys87和cys104形成的二硫键和N-端 谷氨酰氨环化构成了与RNase A结构的主要不同点(Amold U等， Biochemistry，45：3580-7)。在氢键等弱相互作用下，分子内部形成7个β-折叠， 4个α螺旋和4个β-转角，其中有1个正平行三β-折叠和1个反平行三β-折 叠。

ONC及其前身北极豹蛙卵粗提物Pannon^TM，都是由Alfacell公司开发，并拥有 有关ONC商标和专利权，其中包括10项美国专利、4项欧洲专利和1项日本专利。 临床上使用的ONC是从豹蛙卵中提取的，步骤包括：体内受精，排卵，提取卵母细 胞，阴离子交换色谱，阳离子交换色谱和体积排阻色谱。该方法既费时又费力，代 价高得率低。利用基因工程手段在大肠杆菌中表达的ONC其N端第一个氨基酸均为 Met，且ONC全部以包涵体形式分泌到胞外，为了获得有活性的ONC，必须去除Met 和对包涵体进行变性和复性。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种单细胞低等真核生物，被广泛地 应用于表达各种种属来源的外源蛋白，它是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表 达系统之一，利用巴斯德毕赤酵母表达系统已经成功表达了近700种外源蛋白。毕 赤酵母具有许多其它基因表达系统所不具备的优点：具有强有力的醇氧化酶(AOX I)或磷酸苷油酸脱氢酶(GAP)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达。作为 真核表达系统，可对表达的蛋白质进行翻译后加工、折叠和修饰等，从而使表达出 的蛋白质具有生物活性。生长繁殖速度快、营养要求低、培养基廉价，与高等真核 细胞相比，巴斯德毕赤酵母易于操作和培养。高稳定性。外源基因能通过质粒整合 到毕赤酵母的基因组上，这样得到的基因工程菌株比较稳定，不会出现外源基因随 生长繁殖而丢失的现象。高生物量。工程菌株可进行高密度发酵培养，并能耐受较 高流体净压，在发酵罐中细胞干重可达120g/L以上。表达量高，许多外源蛋白在 毕赤酵母中的表达可达到每升克级水平以上，例如巴西三叶胶羟腈裂解酶的表达量 可以达到22g/L。在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内，又可分泌至胞外，而 且毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，有利于纯化。糖基化程度低，免疫原性较低， 因此特别适合于生产医药用重组蛋白质。