[发明专利]一种可定量检测鼠疫耶尔森菌的蛋白悬浮芯片及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种可定量检测细菌的蛋白质悬浮芯片及其制备方法，尤其是适合定量检测和分析鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)的蛋白质悬浮芯片。

背景技术

鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)为呈革兰氏染色阴性、不运动、不形成芽孢的球杆菌，吉母萨、瑞特氏或威森染色呈双极浓染，能在4-40℃范围内生长，最适生长温度为28-30℃，最适生长pH值为7.2-7.6，pH的耐受上下极限分别为pH5.0和pH9.6。鼠疫菌由假结核菌进化而来，正处在进化的活跃时期，其主要宿主为啮齿动物，主要通过蚤的叮咬在动物间传播。偶尔可经跳蚤叮咬或接触带有鼠疫菌的动物、动物皮毛等引发人类疾病。患者在被染有鼠疫菌的跳蚤叮咬216天后，出现腺鼠疫的症状如发热、寒颤、头痛、虚弱、呕吐，淋巴结肿大。原发性败血型鼠疫的临床症状与其他G-引起的败血症类似，引起病人发烧、寒颤、头痛，有少数患者会由败血型鼠疫发展为肺鼠疫。通过呼吸道途径感染的患者发生原发性肺鼠疫，潜伏期为113天，起初象流感症状，迅速发展为肺炎并伴有咳嗽和血痰。腺鼠疫不经治疗的死亡率约为60％，用抗生素治疗后降低到5％以下；败血型鼠疫和肺鼠疫不经治疗死亡率高达100％。

鼠疫在历史上曾经引起三次世界范围的大流行，使人类遭受了深重的灾难。随着医疗卫生水平的提高，鼠疫已经得到较好的控制。但是，20世纪90年代以来，世界鼠疫开始活跃，发病人数和疫源地面积都有扩大的趋势，2000年世界卫生组织(WHO)将鼠疫列为重新抬头的传染病。同时，鼠疫菌传染性强、发病迅速，是生物战剂和生物恐怖的重要病原之一。

出于公共卫生和国家安全的目的，研究和开发快速、定性、定量检测传染病病原体是所属技术领域中长期致力追求的目标。尤其对于鼠疫菌来说，作为一种烈性传染病的病原体，能否实现定量检测至关重要。目前用于鼠疫菌的实验室常规检测方法有细菌学检测方法、血清学检测方法及检测核酸的分子生物学方法(Perry，R.D.&Fetherston，J.D.Yersinia pestis--etiologic agent of plague.Clin Microbiol Rev1997，10(1)，35-66.)。但是，细菌学检测方法、血清学检测方法(例如间接血凝方法)及核酸检测法等现有检测技术存在许多缺陷。对于细菌学检测法，细菌培养耗时较长，不适合对鼠疫菌的快速检测。荚膜抗原(F1抗原)是目前公认的鼠疫菌种特异性抗原之一，检测鼠疫菌F1抗原及其抗体是鼠疫诊断的重要依据(Drobkov VI，Abdullin JG，DarmovIV.Use of the enzyme immunoassay in the laboratory diagnosis ofplague[J].Zhurnal Mikrobiol.Epidemiol.Immunobiol.1992，16(10)：40-42.；Williams JE，Arntzen L，Tyndal GL，Isaacson M.Applicationof enzyme immunoassay for the confirmation of clinically suspectplague in Namibia，1982.Bull.W.H.O.1986，62：745-752.)。检测鼠疫菌特异性抗体(F1抗体)的间接血凝方法(IHA)，灵敏度低，特异性差(Williams，J.E.，Arntzen，L.，Robinson，D.M.&et al.Comparison of passive haemagglutination and enzyme-linkedimmunosorbent assay for serodiagnosis of plague.Bull WHO 1982，60，777-781.)。对于核酸检测法，尽管采用了PCR技术对鼠疫菌进行检测和分析(Hinnebusch，J.&Schwan，T.G.New method for plaguesurveillance using polymerase chain reaction to detect Yersiniapestis in fleas.J Clin Microbiol 1993，31(6)，1511-1514.；Higgins，J.A.，Ezzell，J.，Hinnebusch，B.J.，Shipley，M.，Henchal，E.A.&Ibrahim，M.S.5′nuclease PCR assay to detect Yersinia pestis.JClin Microbiol 1998，36(8)，2284-2288.；Neubauer，H.，Meyer，H.，Prior，J.，Aleksic，S.，Hensel，A.&Splettstosser，W.Acombinat ion of different polymera se chain reaction(PCR)assaysfor the presumptive identification of Yersinia pestis.J Vet MedB Infect Dis Vet Public Health 2000，47(8)，573-580.)，尤其是实时荧光定量PCR技术(Herber t，T.，Emil，C.R.，Sascha，A.D.&etal.Rapid detection of Yersinia pestis with multiplex real-timePCR assays using fluorescent hybridisation probes.FEMS ImmunolMed Microbiol 2003，38，117-126)，特异性高，不容易被污染，但是现有PCR技术的方法繁琐，特别是此类方法包括DNA/RNA的提取和复杂的操作步骤，而且不能用于非核酸物质如蛋白质的检测，因此核酸检测法具有局限性且不方便。