[发明专利]PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种用特异性引物和探针同时检测猪繁殖与呼吸 综合征病毒经典株与高致病性变异株的方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪 繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引 起的接触性传染病。PRRSV首先在荷兰和美国分离到，并分别作为欧洲型(LV)和美 洲型(VR-2332)的原型毒株。目前PRRS已经遍及全球各养猪业发达的国家和地区， 给世界养猪业及其相关行业带来了巨大的经济损失。近年来，我国相继分离了PRRSV CH-1a、S1、HB-1和HB-2等毒株，经鉴定均为美洲型PRRSV。2006年6月份以来， 我国大多数省份的养猪场、户爆发猪“高热病”疫情，临床上以体温高、发病率高、死亡 率高为特征，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。2007年1月，农业部已确定其原 发病因是PRRSV高致病性变异株，源于美洲型PRRSV，但其毒力远高于以前国内流行 的PRRSV毒株。

目前检测PRRSV的常用方法主要有病毒分离鉴定、血清学检测以及普通RT-PCR， 但这些常规方法费时费力、敏感性低且容易出现假阳性。国内外已建立了针对所有 PRRSV的实时荧光RT-PCR检测方法，但此方法只能检测是否有PRRSV感染，无法判 定是PRRSV经典株感染，或者是PRRSV高致病性变异株感染，或者是两者共同感染。 此外，已有的针对PRRSV高致病性变异株的实时荧光RT-PCR检测方法，只能检测 PRRSV高致病性变异株，无法判定是单一PRRSV高致病性变异株感染，还是PRRSV 经典株与高致病性变异株共同感染。即使将现有的两种PRRSV实时荧光RT-PCR方法 联合使用，依然无法判定是否存在共同感染的问题，无法为我国快速、有效地监控PRRSV 疫情提供强有力的技术支持。因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性 好的PRRSV经典株与高致病性变异株“一步”鉴别的检测方法意义重大。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种PRRSV经典株与高致病性变异株 双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法。此方法只需一次检测便能判定样本是否含有 PRRSV经典株，或者含有PRRSV高致病性变异株，或者是两者共同感染。此方法快速 简便、特异性强、敏感性高、可靠性好，可以同时进行大批量的样本分析，为PRRS疫 情的监测、防控提供强有力的技术支持，有很好的应用前景。

本发明是通过以下技术方案实现的：

PRRSV经典株：美洲型PRRSV标准毒株VR2332和国内分离株CH-1a，由农业部 兽医诊断中心提供。

PRRSV高致病性变异株：由中国动物疫病预防控制中心分离鉴定的NVDC-JXA1 毒株，保藏编号为CGMCC No.1964，涉及的专利号为ZL200710086549.7。

在本发明的研究过程中用到的其他毒株包括：欧洲型PRRSV标准毒株LV，马动 脉炎病毒(EAV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒(PCV1， PCV2)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病毒(PRV)均由农业部兽医诊断中心提供。

(1)病毒特异性引物和探针设计

所述的病毒特异性引物，指的是：长度为20个碱基左右的寡核苷酸链，与PRRSV 经典株、PRRSV高致病性变异株ORF1a基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同 或者反向互补；

所述的病毒特异性探针，指的是：长度为13到21个碱基之间的寡核苷酸链，其5’ 端标记FAM或HEX等荧光激发基团，3’端标记自身不发光的淬灭基团，同时另增加一 个小沟结合物(minor groove binder，MGB)分子，与PRRSV经典株、高致病性变异株 ORF1a基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或反向互补。

本文所列出的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向书写。

①用于检测PRRSV经典株的核苷酸扩增引物和探针序列包括：