[发明专利]地衣芽孢杆菌整合表达盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及地衣芽孢杆菌整合表达盒及其应用。

背景技术

基因工程领域最成熟的外源蛋白的表达系统是大肠杆菌和酵母表达系统。市场上广泛销售的也主要是大肠杆菌和酵母表达系统。

地衣芽孢杆菌表达系统具有以下优点：

(1)地衣芽孢杆菌有较枯草芽孢杆菌更有效的蛋白分泌机制，可将产物分泌到细胞外，避免了纯化产物时需要破碎细胞的繁琐步骤，从而提高产物回收率，简化纯化步骤。

(2)地衣芽孢杆菌本身是对人畜无害的无致病性微生物，没有大肠杆菌的内毒素，为食品级安全的微生物。

(3)多年来地衣芽孢杆菌已经用于工业生产多种酶制剂，发酵工艺成熟。

发明内容

本发明的目的是提供一种地衣芽孢杆菌整合表达盒及其应用。

本发明所提供的表达盒，依次包含LacA基因5’臂、血红蛋白基因、筛选标记基因和LacA基因3’臂；所述LacA基因5’臂为选自β-半乳糖苷乙酰基转移酶基因5’端至少600bp的DNA片段；所述LacA基因3’臂选自β-半乳糖苷乙酰基转移酶基因3’端至少600bp的DNA片段。

其中，所述血红蛋白基因和所述筛选标记基因之间还可含有外源基因表达盒，所述外源基因表达盒从上游至下游依次包括α-淀粉酶基因启动子、果聚糖合成酶基因启动子和信号肽序列、多克隆位点和转录终止序列。

所述血红蛋白基因为透明颤菌的血红蛋白基因，包括血红蛋白基因的启动子、信号肽序列和编码基因。所述血红蛋白基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列6。所述筛选标记基因可为红霉素抗性基因；所述红霉素抗性基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列8。

所述LacA基因5’臂的核苷酸序列具体可为序列表中的序列1，所述LacA基因3’臂的核苷酸序列具体可为序列表中的序列5。所述α-淀粉酶基因启动子的核苷酸序列具体可为序列表中的序列2；所述果聚糖合成酶基因启动子和信号肽序列的核苷酸序列具体可为序列表中的序列3。所述多克隆位点和转录终止序列的核苷酸序列具体可为序列表中的序列7。

含有所述表达盒的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种生产高温淀粉酶的方法。

本发明所提供的生产高温淀粉酶的方法，是将所述的表达盒导入地衣芽孢杆菌中，获得重组菌，发酵所述重组菌生产高温淀粉酶。

本发明的地衣芽孢杆菌表达盒具有地衣芽孢杆菌的LacA基因5’和3’臂，可以双交换方式整合到地衣芽孢杆菌基因组中，提高整合效率；该表达盒还带有血红蛋白基因，地衣芽孢杆菌在对数生长期生长很需要能量和氧的供应，颤菌血红蛋白能结合氧，在地衣芽孢杆菌需要氧时，可以释放氧，并且血红蛋白基因5’端带有信号肽序列，有利于血红蛋白分泌到细胞外，利于发酵工业生产。将本发明的地衣芽孢杆菌表达载体导入产高温淀粉酶的地衣芽孢杆菌中，用该菌生产高温淀粉酶，酶活可达到9100U/ml发酵液，比野生菌提高2.1倍。

附图说明

图1为地衣芽孢杆菌表达载体图谱。

具体实施方式

本发明的地衣芽孢杆菌表达载体由A、B、C、D、E、F、G和H八个基因片段组成。A、C、D、F和H基因片段来自地衣芽孢杆菌CICC10181(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC10181)的基因组DNA.B片段来自透明颤菌vitreoscilla(美国标准生物收藏中心，保藏编号为ATCC 15551)的基因组DNA。E片段人工合成。G片段来自载体pAXOI(美国俄亥俄州立大学菌种保存中心(BacillusGenetic Stock Center(BGSC)The Ohio State University购得)采用常规的融合PCR分子生物学技术将八个基因片段连接到一起。融合PCR的引物序列的5’端和3’端各包含一段待融合的模板序列，相当于衔接头，将相邻的两个DNA序列连接到一起。引物的核苷酸序列如下：

引物PaF：5’gaatccATTCAATCTGTGACCAATCGTTG 3’；

引物PaR：5’CTTAAAACTTAATCCACATATACGACCCAAGCAAGATAC3’。

引物PbF：5’GTATCTTGCTTGGGTCGTATTGTGGATTAAGTTTTAAG3’；