[发明专利]X染色体MiniSTR荧光复合扩增试剂盒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种PCR扩增试剂盒，尤其涉及一种单管同时检测12个X染色体MiniSTR基因座的荧光复合扩增试剂盒，本发明还涉及该荧光复合扩增试剂盒的制备方法以及该试剂盒在司法鉴定领域中的应用，属于X染色体分型和鉴定领域。

背景技术

短串联重复序列(short tandem repeat，STR)是人类基因组中由2～6个碱基作为核心单位串联重复形成的一类具有长度多态性的DNA序列，其核心单位的数目变化和重复次数不同构成了STR的遗传多态性。STR分布广、数目多，约占人类基因组的10％，所包含的遗传信息是以往任何多态性标记所无法比拟的，因此STR是目前法医DNA鉴定中最常用和最重要的遗传标记。

X染色体STR(X-STR)属性染色体，在男性个体中呈单倍型形式存在，只能遗传给女儿，因此同父所生的姐妹在X-STR基因座上有一个相同的等位基因；而男性中的X-STR只能从其母亲中得到，故孙女中X-STR基因座的等位基因有一半与其祖母相同。由于其遗传的特殊性，X染色体STR在亲权鉴定中存在一些其它染色体(如常染色体、Y染色体及线粒体)遗传标记无法比拟的优点。尤其在一些特殊的检案中，如缺乏双亲的同父异母姐妹亲缘关系认定或涉及父女关系的单亲亲权鉴定等方面，对于缺乏双亲的同父异母姐妹俩人认亲的案件，常染色体STR无法排除姐妹关系，线粒体的遗传标记也不能用来确定同父所生的关系。检测X染色体的STR基因座，若俩人间没有相同的等位基因，就可作俩人不是同父所生的结论；而对于单亲父女关系的鉴定案件，因父亲的X染色体必遗传给女儿，如果女儿的X-STR基因座的等位基因与被假定父亲的不同，可以直接排除父女关系，如果相同，则不能排除其父女关系。此外，性别鉴定也是法医学个人识别的重要内容之一，X染色体STR进行分型检测时，男性个体X-STR只显现一条等位基因片断，女性杂合子则显示两条等位基因片段，因此可以用来作为性别的辅助鉴定。此外，对于男性除精液(斑)外的体液(斑痕)或组织样品，单一男性样品DNA只有一个X染色体DNA，X-STR基因座只有一个等位基因。如果出现两个或两个以上等位基因则表明被检样品混有其他个体DNA，为混合样品。即使是同胞个体间DNA混合样品，也有可能被检出。鉴于X染色体STR分型在法医特殊DNA检案中具有的重要价值，开发新的X-STR复合扩增试剂盒将有很好的发展前景。

目前常染色体和Y染色体STR基因座在国际上应用较为广泛，已有多套成熟的商品化试剂盒出现，如Profiler Plus、Cofiler、Identifiler、PowerPlex 16、Y-PLEX^TM12kit、AmpFLSTR Y-filer kit。相比之下，尽管X染色体STR基因座具有高度的多态性，但X染色体STR基因座的研究及应用还不普遍，遗传学数据库(genetic databank，GDB)中绝大多数X-STR基因座尚未进行群体调查。商品化试剂盒也仅有德国的MentypeArgus X-8(DXS8378，HPRTB，DXS7423，DXS7132，DXS10134，DXS10074，DXS10101 DXS10135)，其在我国法医DNA检验中还存在基因座数目和个人识别能力的限制。

国内文献报道的关于X-STR可复合扩增的基因座数目较少(通常3-6个)，且多为银染检测，在对扩增结果进行分析时，必然存在费时、自动化程度低，准确性差等弊病，虽然对实验设备的要求不高，符合当前国内法医基层实验室的需要，但却不能满足大多数已经具有自动激光荧光遗传分析仪的实验室的更高要求。而即便是采用荧光检测，也多是将若干用于单基因座扩增的引物直接加荧光标记复合扩增，但随着扩增体系中引物数量的增加，引物之间的相互影响严重，反应动力学变得复杂，扩增条件的优化变得极为困难，成为进一步增加复合扩增基因座数目的难点。

本申请人曾作为中国发明专利ZL031355755.5的研发人员，把传统的多对引物扩增多个STR基因座(多重复合扩增反应)，转换为一对公共引物同时扩增多个STR基因座(一重复合扩增反应)，解决了上述传统复合扩增的技术难点。另一方面，MiniSTR技术通过重新设计引物，减小PCR-STR扩增产物片段长度是目前解决法医难检DNA样本分型难题的一个新的发展方向。鉴于此，优选适合中国群体遗传分布和法医检验的X染色体STR基因座，结合MiniSTR技术，研发一套具有自主知识产权的X染色体复合扩增试剂，对特殊检案的DNA样本正确分析和实现我国法医DNA检验关键试剂国产化具有重要意义。

发明内容