[发明专利]一种腈水合酶基因簇及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说涉及一种腈水合酶基因簇及其在丙烯酰胺生产中的应用。

背景技术

腈代谢酶系主要包括腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。在腈代谢酶系的参与下，含腈代谢酶系的菌株可将毒性很强且难以降解的腈类转变为酰胺或羧酸加以利用。其中，腈水合酶(Nitrile Hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)可以催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺，酰胺酶则进一步将丙烯酰胺催化水解生产丙烯酸。由于腈水合酶催化丙烯腈生成丙烯酰胺的生物催化过程反应条件温和、产率高、副产物少、产物的自聚损失少，环境污染小、生产成本低，而且具有区域选择性、立体选择性和光激活性，近年来广泛用于生产丙烯酰胺，并将进一步应用于其它多种氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。

能产生腈水合酶的微生物的分布相当广泛，如红球菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、棒状杆菌、假单胞菌、产碱杆菌或短杆菌等。在细菌以及高等的真核生物的遗传图谱中，普遍存在着许多基因在染色体上成簇排列。基因簇的定义就是编码不同蛋白的多个基因片段按照一定的顺序首尾相连的排列在一起，由一个启动子启动他们的表达，表达的蛋白大多能相互调控，相互协作完成一系列的代谢功能。而腈水合酶和酰胺酶通常就位于这样一个典型的基因簇上。

绿针假单胞菌B23的腈类化合物代谢基因编码五种蛋白的开放阅读框，依次为酰胺酶基因、NHaseα亚基基因、β亚基基因、p47K基因和OrfE基因(Nishiyama等，J.Bacteriol.，1991，173：2465~2472)。在被称为生产丙烯酰胺的第三代生物催化剂的玫瑰红球菌J1(Rhodococcus rhodochrous J1)中不仅含有2种不同的腈水合酶，分别为高分子量腈水合酶(H-NHase，520kDa(千道尔顿))和低分子量腈水合酶(L-NHase，130kDa)，而且两种腈水合酶基因也都是以基因簇的形式出现(Komeda等，Biol.Chem.，1996，271(26)：15796~15802；Komeda等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93(9)：4267~4272)。编码L-NHase的α、β亚基的下游1.9kb(千碱基对)为编码酰胺酶的基因，而上游3.5kb区域内分别是负调控子和正调控子基因。编码H-NHase的α、β亚基的上游4.6kb区域至少还存在5个开放阅读框(ORF1~5)。其中ORF1和ORF2是腈水合酶表达的正调控基因，ORF4(即基因簇中的插入序列IS1164)则参与金属离子的转运过程。在红球菌N-774中，也发现了酰胺酶-腈水合酶基因簇，他们在同一个启动子的调控下启动(Hashimoto，等，BiosciBiotechnol Biochem，1994，58(10)：1859~1865)。红球菌N-771的腈水合酶基因簇包含6个基因，依次编码腈水合酶调控子2、腈水合酶调控子1、酰胺酶、腈水合酶α亚基、腈水合酶β亚基和腈水合酶激活子(Nojiri等，J.Biochem.(Tokyo)，1999，125(4)：696~704)。玫瑰红球菌Rhodococcus rhodochrous M8的腈水合酶基因簇依次编码腈水合酶正调控子1、腈水合酶调控子2、腈水合酶β、α亚基和腈水合酶激活子(Veiko等，Biotekhnologiia(Mosc.)，1995，5，3-5)。芽孢杆菌BR449的腈水合酶基因和酰胺酶基因同样是以基因簇的形式存在，核苷酸测序发现6个开放阅读框，它们依次编码2个推定的未知蛋白、酰胺酶、腈水合酶β与α亚基和1个推定的由101个氨基酸残基组成的小蛋白p12K；从编码区的间隔和方向上可以判断，酰胺酶、β亚基、α亚基和p12K的基因共转录(Kim等，Enzyme and Microb Technol，2000，27(7)：492~501)。红球菌Rhodococcus sp.RHA1中的酰胺酶基因和腈水合酶基因也位于同一个大基因簇上，且被质粒pRHL2携带(Okamoto et al.Molecular Microbiology，2007，65(3)，828-838)。

总之，在上述已经发现报道的腈水合酶和酰胺酶基因簇中，以玫瑰红球菌J1的低分子量腈水合酶基因簇、红球菌N-774的腈水合酶基因簇和芽孢杆菌BR449为代表，酰胺酶基因和腈水合酶基因位于同一个基因簇上。而在玫瑰红球菌J1的高分子量腈水合酶基因簇和玫瑰红球菌M8中，腈水合酶基因和酰胺酶基因不在同一个基因簇上。

发明内容

本发明目的在于提供一种腈水合酶基因簇。