[发明专利]一种对DNA片段进行测序的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对DNA片段进行测序的方法。

背景技术

小麦是世界上的主要粮食作物，是我国的第三大类粮食作物，在人类生存和国 家粮食安全中起着十分重要的作用。小麦籽粒含有丰富的营养成分，其中蛋白质约 占籽粒营养成分的8％~10％，包括水溶性的白蛋白、盐溶性的球蛋白、醇溶性的醇溶 蛋白及溶于酸或碱的谷蛋白类。通常将小麦中的白蛋白、球蛋白和酶蛋白等统称为 代谢蛋白，大约占籽粒蛋白的15％左右；将麦醇溶蛋白和麦谷蛋白称为小麦的贮藏 蛋白，约占籽粒蛋白的85％。麦醇溶蛋白的组成和含量决定面团的粘着性和延伸性， 而麦谷蛋白亚基组成及含量决定面团的弹性。小麦的麦谷蛋白按其分子量大小又分 为高分子量麦谷蛋白亚基(high molecular weight glutenin subunits，简称HMW-GS) 和低分子量麦谷蛋白亚基(low molecular weight glutenin subunits，简称 LMW-GS)，其中HMW-GS是面筋的主要成份，与小麦的加工品质密切相关，赋予面团 弹性，决定面包的烘烤品质。

小麦高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)基因定位于第一组染色体(1A，1B，和 1D)长臂的Glu-1位点。HMW-GS每个位点由两个紧密连锁的基因组成，分别编码两 个不同类型的亚基：一个分子量较高的X型亚基和一个分子量较低的Y型亚基。X 与Y型亚基基因之间的距离在10kb以内。Glu-7位点为复等位基因，Payne和 Lawrence(1983)报道了在Glu-1位点中Glu-1A有3个等位基因、Glu-1B有11个 等位基因、Glu-1D有6个等位基因。此后更多的等位基因被鉴定出来。

对高分子量麦谷蛋白亚基基因的分离和克隆，早期是通过探针杂交筛选文库的 方法获得的。随着PCR技术的发展，其作为一种快速可靠的方法，在小麦及其近缘 物种的HMW-GS基因研究中得到广泛应用。D’Ovidio等(1995)通过PCR方法对六倍 体小麦中的6个HMW-GS基因的完整编码区进行了特异扩增。这就使得人们可以对 HMW-GS的遗传多态性、新的等位基因变异的分离、分子大小的估计及半胱氨酸残基 数量进行研究。此后发现在Glu-1位点编码的HMW-GS长度上的不同主要是由于中部 重复区长度上的变异造成的。一些研究者指出产生麦谷蛋白亚基大小上的差异最可 能的机制是一个不平衡的交换事件造成的。不平衡的交换事件也可能由于一些重复 基序的插入造成一个很长的基因出现，也有可能由于一些重复基序的缺失造成一个 很短的基因，如在T.tauschii中的12.4亚基。

HMW-GS基因的长度一般在1.5kb～3.0kb之间，由于其中部重复序列多、GC含 量高，中间设计引物非常困难，无法通过一般的测序方法(primer walking)测通， 目前对这类基因的序列测定都是用嵌套缺失的方法(nested deletion)产生一系 列的亚克隆重叠群，然后将这些重叠片段利用计算机软件拼成全序列。但这种方法 对质粒要求高，需要90％以上的超螺旋质粒，并要控制好酶切时间。

发明内容

本发明的目的是提供一种对DNA片段进行测序的方法。

本发明所提供的对DNA片段进行测序的方法，包括如下步骤：

1)以待测DNA片段为起始片段；

2)对所述起始片段进行一端测序或两端测序，得到所述起始片段的一端序列 或两端序列；

3)用所述起始片段的一端序列或两端序列上存在的至少一个限制性内切酶位 点对应的至少一种限制性内切酶酶切所述起始片段，回收含有所述起始片段中未测 序片段的片段；

4)对含有所述起始片段中未测序片段的片段进行测序，得到所述含有所述起 始片段中未测序片段的片段的序列；

5)将所测得的所有序列进行拼接得到所述待测DNA片段的序列。

其中，用于酶切的限制性内切酶可以是1种、2种或3种以上，具体可以根据 所要测的DNA片段的序列特征进行选取。

所述方法中，在所述步骤3)和步骤4)之间，还可包括下述操作：以所述步 骤3)中所述含有所述起始片段中未测序片段的片段为起始片段，重复所述步骤2) 和3)。

所述方法中还可包括至少2次以下重复的操作：在所述步骤3)和步骤4)之 间，重复所述步骤2)和3)的操作，其中，进行一端测序或两端测序的起始片段 为前一次重复中得到的含有所述起始片段中未测序片段的片段。