[发明专利]一种高纯度那他霉素的非溶剂制备方法

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及到一种从发酵培养物中不用有机溶剂直接分离纯化制备高纯度那他霉素粉末的绿色环保的制备方法。

背景技术

那他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，是一种白色至乳白色几乎无臭无味的结晶粉末。分子式C₃₃H₄₇NO₁₃，分子量为665.73。化学结构式如下：

那他霉素是纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalenis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)或褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosPoreus)等微生物的次级代谢产物，从发酵液中提取纯化后获得。那他霉素是一种高效、低毒的具有广谱的抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和藻类剂，可以用于医疗、食品、饲料、粮储防霉，特别是在食品原料保鲜、食品防腐等方面具有良好的使用(陈冠群，季波.那他霉素的特性及应用.中国乳品工业，2002，30(4)，26-28)。由于那他霉素对酵母菌及霉菌等丝状真菌有极强的抑制或杀灭作用，美国FDA于1982年6月正式批准那他霉素可用作食品防腐剂(衰亦承.那他霉素[J].中国食品用化学，1997，1(3)：37-41)，是目前国际上批准使用的仅有的两种生物食品防腐剂之一。中国食品添加剂标准化技术委员会于1996年正式批准那他霉素可作为食品防腐剂(衰亦承.那他霉素[J].中国食品用化学，1997，1(3)：37-41)。

该产品在欧洲已经有35年的使用历史(FDA.Federal Register Rules andRegulations 21CFR 172.155，2001，66(46)，13846.)。现在在国际市场上还有多家公司在生产销售该产品作为人类用药，例如，5％那他霉素无菌溶液是世界上用于治疗角膜真菌炎症的首选抗生素(FDA.Natamycin approved-firstU.S.drug for fungal keratitis.FDA Drug Bulletin，1978，8(6)，37-38)，其商品名为NATACYN等。华北制药集团新药研究开发有限责任公司于2008年取得那他霉素医药级原料和眼用制剂的生产文号，成为国内首家高纯度医药级那他霉素原料药的生产企业。

由于那他霉素含有四个相连的双键结构，决定了那他霉素几乎不溶于水，在水中的溶解度仅为52mg/ml(Brik，H.Natamycin.Ch，In Analyt ical Profilesof Drug Substances，Vol.10.K.Florey(Ed.)，Academic Press，Inc.NewYork，1981，513-561)。那他霉素微溶于甲醇，溶于冰醋酸。由于那他霉素的溶解特性，很多用于那他霉素分离的工艺为溶媒提取结晶和物理分离。

英国专利GB846933报道了从发酵液中用混合性极性溶剂如甲醇、丁醇和丙酮，采用萃取法提取那他霉素。专利GB2106498报道了体积浓缩法和从滤液中用丁醇回收那他霉素，从而获得了一种抗真菌混合物原液，从中可分离那他霉素。世界专利WO92/10580报道了在低pH下用甲醇溶解那他霉素，然后除去固形物，提高pH以沉淀出那他霉素。美国专利US5942611报道了一种有效的提取高质量那他霉素的方法，该方法将错流过滤得到的发酵液浓缩，调节发酵液的pH在10-11，添加有机溶剂如乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮等溶解发酵液中的那他霉素。错流过滤除去不溶物，调节过滤液的pH在5.5-7.5范围内，过滤得到析出的晶体，产品纯度可以达到94-99％(无结晶水计算)，那他霉素回收率可达40-70％。这些提取过程一般要求多级纯化，操作费用比较昂贵，同时这些工艺均属于溶媒提取结晶工艺，使用的溶剂量，损耗大，造成那他霉素的生产成本较高。

WO97/29207公布了一种不加有机溶剂而直接从发酵液中回收那他霉素的物理分离方法。该方法在那他霉素发酵单位不低于7g/l时，首先将发酵液中的菌丝体破碎成远远小于那他霉素晶体的微小颗粒，然后利用重力梯度离心，将密度和颗粒大小相差很大的那他霉素品体和菌丝体碎片进行分离，从而获得那他霉素。由于该工艺对发酵液质量和分离设备要求严格，因此很难实现规模化生产。