[发明专利]用于快速光学跟踪单分子的方法及其装置

说明书

技术领域

本发明涉及一种单分子荧光光谱的检测与信号处理技术，具体为用于快速光学跟踪单分子的方法及其装置。

背景技术

多年以来，人们对微观世界的观测和研究都是建立在多分子系综平均的基础上。直到二十世纪八十年代扫描隧道显微镜和光镊技术等的出现，进而九十年代单分子科学的形成与发展才使人们在原子、分子尺度上观察和操纵微观物质世界。单分子探测可以揭示生物大分子的结构和运动状态，对于空间分布的样品，例如一个活体细胞，单分子探测能够提供被研究分子的精确位置，可以直接、无介入地观察活体细胞中微量的生物高聚物以及定量测量复杂生物过程的动力学和统计行为。

单分子快速跟踪与定位是研究分子探针、纳米材料和分子反应动力学等的重要手段和关键技术。目前，单分子的光学探测与定位的一般方法是由激光器输出激光脉冲，激光首先经过二向色镜反射进入显微镜物镜，然后聚焦到置于平移台的样品上对被研究的分子进行激发，分子被激光激发后，自发辐射的荧光光子被该物镜收集，沿着激发光相反的方向透射通过二向色镜，然后进入探测系统，通过采用对分子荧光长时间积分的CCD成像测量方法确定分子的空间位置。但是这种方法需要长的积分时间，一般为几分钟至数十分钟，会掩盖单分子的精细动态变化过程，不能满足快速、实时跟踪单分子运动轨迹的测量要求。

发明内容

为了能够实时显示单分子的空间位置和快速跟踪单分子的运动轨迹，本发明提供一种快速光学跟踪单分子的方法以及实现这一方法的装置，可应用于材料科学、生物学、医学、环境科学等涉及单分子实时测量与跟踪方面的领域。

本发明采用的技术方案是：用于快速光学跟踪单分子的方法，由脉冲激光对单分子样品进行扫描，样品中的单分子被共振激发后辐射荧光，接收单分子发出的荧光光子，将荧光光子到达的事件通过光电转化为一个标准的逻辑电脉冲输出信号，在采样时间内对逻辑电脉冲进行计数，获得荧光的光子计数光谱，对获得的光子计数光谱结果转换成相应的模拟电压信号后进行高斯拟合得到荧光强度最大点的位置即为单分子所处的空间位置，把相应的单分子位置坐标反馈到三维纳米平移台，以此点为中心在在单分子移动范围内重新扫描，确定单分子新的空间位置，通过记录每次扫描获得的单分子的中心位置，实现单分子的跟踪定位。

为了抑制背景噪声对单分子荧光信号探测的影响，从而获得实际被测荧光的荧光光谱，本发明采用的一种优选的技术方案是采用正弦调制电压作为激光强度调制信号，用调制后的激光照射单分子样品，将获得的荧光光子计数光谱结果转换成相应的模拟电压信号后输入锁相放大器，同时将正弦波形调制电压输入锁相放大器，对信号进行解调，通过解调获得实际被测单分子的荧光光谱，再对实际被测单分子的荧光光谱进行高斯拟合。

本发明还提供一种实现上述方法的装置，脉冲激光器产生的激光由一个二向色镜反射后通过显微镜物镜聚焦于样品单分子上，分子被激光激发产生的荧光由显微镜物镜收集，通过二向色镜进入单光子探测器转化为逻辑电脉冲信号，单光子探测器与单光子计数与数模转换系统连接，进行光子计数采集并将这些数字信号线性转换成模拟信号进行处理，计算机控制系统连接三维纳米平移台和单光子计数与数模转换系统，计算机控制系统对信号分析后把单分子位置反馈给三维纳米平移台。

抑制背景噪音的调制解调的装置是声光调制器连接脉冲激光器，信号发生器输出的正弦信号加载在声光调制器的驱动模块上，声光调制器对脉冲激光器输出的激光进行强度调制，单光子计数与数模转换系统和信号发生器分别连接锁相放大器对被调制的模拟信号进行解调，解调后的信号输入与锁相放大器相连的计算机控制系统。

与现有技术相比，本发明的特点是：

(1)采用单光子探测技术能够快速地确定与跟踪单分子位置。

(2)光电反馈控制纳米平移台中心位置随单分子位置变化可以实时反映出单分子运动轨道。

(3)调制与解调技术的使用有效抑制了背景噪声对单分子荧光信号探测的影响。

附图说明

图1为实现本发明所述的装置结构示意图；

图2(1)为单分子荧光计数的1.2×1.2μm空间扫描成像；

图2(2)为y＝-0.12μm位置的荧光光子计数结果；

图2(3)为y＝-0.12μm位置经过调制与解调后的荧光光谱(虚线)和高斯拟合结果(实线)。

图3为跟踪测量分子位置图。

图1中：1-脉冲激光器；2-声光调制器；3-单光子探测器；4-单光子计数与数模转换系统；5-锁相放大器；6-函数信号发生器；7-计算机控制系统；8-三维纳米平移台；9-显微镜物镜。

具体实施方式