[发明专利]一种心律失常动物模型建立的方法

权利要求书

1.一种心律失常动物模型建立的方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)构建pBluescript-miR328质粒：选取Pubmed上C57BL/6J小鼠Pre-miR328序列，以基因组为模板，利用含Sal I和Hind III酶切位点的克隆引物，经PCR扩增获得含有该前体序列及其上下游侧翼序列；Sal I和Hind III酶切上述PCR产物与pBluescript载体，CIP对载体去磷酸化，纯化后，经T4连接酶将二者连接，连接产物转化入感受态细胞DH5α，确定重组质粒pBluescript-miR328；

(2)建立miR-328转基因小鼠模型：以Spe I双酶切上述重组质粒，电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件，该构件包括心肌特异启动子α-MHC、pre-miR-328、侧翼序列和转录终止信号；选取雌性B6小鼠将全部输卵管依次置于含透明质酸酶的胚胎培养液中分离受精卵，进行体外培养，将经显微注射后成活的受精卵移植于见栓雌性ICR小鼠的输卵管壶腹部，待雌性ICR小鼠分娩；

(3)提取与筛选gDNA：将乳鼠尾尖置于消化液中，加入PCI、异丙醇，以70％乙醇溶液冲洗沉淀，加入170uL1×TE，震荡混匀，以gDNA为模板，用miR-328筛选引物扩增转基因片段；

(4)总RNA的提取与RT-PCR：按Trizol试剂说明进行总RA提取，按逆转录试剂说明进行逆转录获得cDNA，以miR-328筛选引物对其表达进行分析；

(5)建立心律失常的小鼠模型。

2.根据权利要求1所述的一种心律失常动物模型建立的方法，其特征在于所述的构建pBluescript-miR328质粒时Sal l和Hind III酶切上述PCR产物与pBluescript载体3h，CIP对载体去磷酸化1h，纯化后得到5ug产物，经T4连接酶将二者连接，连接产物转化入感受态细胞DH5α50uL，涂板，次日，观察菌落生长情况，挑取7个菌落进行测序，确定重组质粒pBluescript-miR328。

3.根据权利要求2所述的一种心律失常动物模型建立的方法，其特征在于所述的利用含SalI和Hind III酶切位点的克隆引物，经PCR扩增获得含有该前体序列及其上下游侧翼序列的步骤包括用以下引物：ttGTCgAcATCTTCCTGTGTTGCCC，AGaAGCttAGAGGACAAGCATGAAT以小鼠基因组为模板，PCR扩增目的片段，该目的片段含miR-328前体序列及其上下游侧翼序列。

4.根据权利要求3所述的一种心律失常动物模型建立的方法，其特征在于所述的电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件的步骤包括用Spe I酶切构建的质粒10ug，电泳将显微注射片段与载体片段分开，将凝胶中6000bp的显微注射片段进行回收，用Qiangen胶回收试剂盒对其进行纯化，纯化后的片段浓度为200ng/uL。

5.根据权利要求4所述的一种心律失常动物模型建立的方法，其特征在于所述的调整显微注射用转基因构件的浓度至1ng～2ng/uL。

6.根据权利要求5所述的一种心律失常动物模型建立的方法，其特征在于所述的首日13时选取雌性B6小鼠，注射PMSG 5IU/只；隔日12时注射HCG 5IU/只，并与雄性B6小鼠合笼，同时将发情雌性ICR小鼠与结扎输精管的雄性ICR小鼠合笼，第四日将见栓雌性B6小鼠颈椎离断处死，仰卧位开腹，剪取输卵管近卵巢端0.5cm置于生理盐水中，将全部输卵管依次置于含透明质酸酶的胚胎培养液中分离受精卵，进行体外培养，13时进行显微注射。

7.根据权利要求6所述的一种心律失常动物模型建立的方法，其特征在于所述的将经显微注射后成活的受精卵移植于见栓雌性ICR小鼠的输卵管壶腹部，3周后，ICR小鼠分娩，乳鼠生后3w用耳标为其编号，并剪取0.5cm尾尖进行外源基因在基因组整合的鉴定。