[发明专利]产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌互营共培养体的分离筛选方法。

背景技术

产氢产乙酸菌(HPA)又叫专性质子还原菌，是一类真细菌，此细菌于1967年由Bryant首次发现。该细菌主要将短链脂肪酸、醇类等生成甲烷的前体，即乙酸和氢气。但产氢产乙酸细菌一般需要与耗氢的细菌伴生。在厌氧环境中，常见的耗氢细菌有产甲烷细菌和硫酸盐还原菌。而微生物间的这种食物和能量上的相互依赖关系称为“互营现象”，产氢产乙酸细菌与其耗氢伴生菌组成的共培养体就是互营现象的典型代表。

目前只有少数几种得到了纯培养物。在此情况下，分离筛选产氢产乙酸细菌互营共培养体成为一种必然选择。然而，由于产氢产乙酸细菌对自然生境的适应及其对生理生态条件的特殊需求原因，阻碍了此细菌在人工培养基上的复苏和培养，并使得将其分离纯化非常困难，目前产氢产乙酸细菌共培养体的分离筛选方法却只可分离筛选出两种产氢产乙酸细菌共培养体(甲烷菌与产氢产乙酸细菌共培养体和硫酸盐还原菌与产氢产乙酸细菌共培养体)，很大的限制了对产氢产乙酸细菌互营机制的研究。

发明内容

本发明目的是为了现有产氢产乙酸细菌共培养体的分离筛选方法仅能筛选分离出来甲烷菌与产氢产乙酸细菌共培养体和硫酸盐还原菌与产氢产乙酸细菌共培养体两种产氢产乙酸细菌共培养体的问题，而提出的产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法。

产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法按以下步骤实现：一、将具有完整甲烷发酵功能的厌氧活性污泥放入装有数颗玻璃珠的灭菌血清瓶中，通入氮气后封口，而后在温度为35℃、振荡速率为100～200r/min的条件下振荡处理1～3h；二、将经步骤一振荡培养后的厌氧活性污泥接种到装有富集培养基的灭菌血清瓶中，然后在温度为35℃、振荡速率为100～200r/min的条件恒温培养1～3个月；三、按接种量为10％～20％(V/V)将富集培养液接种到液体培养基上培养1～3个月；四、重复操作步骤三至液体培养基对富集培养液降解速率与甲烷产量达到稳定为止，得菌悬液A；五、在氮气环境中，取1mL菌悬液A用无菌厌氧水倍比稀释，然后将1mL经倍比稀释的菌悬液A接种于固体培养基上，而后在35℃的条件下恒温培养至固体培养基上有菌落出现；六、挑取单菌落放在液体培养基中，然后在温度为35℃、振荡速率为100～200r/min的条件恒温培养至有乙酸、甲烷、氢气和二氧化碳产生，得菌悬液B；七、取1mL菌悬液B用无菌厌氧水倍比稀释，然后将1mL经倍比稀释的菌悬液B接种于固体培养基上，而后在35℃的条件下恒温培养至固体培养基上有菌落出现；八、重复步骤六到步骤七25～30次，即可分离筛选出产氢产乙酸细菌互营共培养体。

本发明可成功分离筛选出产氢产乙酸细菌互营共培养体，而由PCR-DGGE图谱测试可知这共培养体均是非产甲烷菌或硫酸盐还原菌与产氢产乙酸菌的互营共培养体。

附图说明

图1为具体实施方式二十三中分离筛选出产氢产乙酸细菌互营共培养体(7-m-2a)扩大1.5万倍的电子显微镜照片，图2为具体实施方式二十三中分离筛选出产氢产乙酸细菌互营共培养体(11-O-1)扩大1.7万倍的电子显微镜照片。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。