[发明专利]一种小麦酯酶生物传感器的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种小麦酯酶生物传感器的制备方法。

背景技术

在当今世界农业发展过程中，尽管绿色和有机已经成为主题，可是现代农业很大程度上仍依赖于一些具有负作用的手段，如农药的使用。有机磷类农药具有品种多、药效高、防治广等优点，在我国农业生产上被大量使用。但是由于有机磷农药及残留物毒性较大，人长期摄入有机磷农药可表现肝功能下降、血糖升高、白细胞吞噬功能减退等一系列病理变化，并有致畸、致癌、致突变的作用，严重者可导致中枢神经系统功能异常，因此有机磷农药残留已成为中国的主要食品安全性问题。解决农产品的关键问题主要依靠建立一种准确快速、简单廉价的农药残留检测技术，这已经成为食品安全和环境保护的当务之急。

生物传感是指一类由生物敏感元件(酶、抗体、受体、细胞及组织器官等)、信号转换器(电极、光纤、半导体、压电晶体、及表面声波、热敏电阻等)和检测器结合在一起来进行检测的技术。它利用生物分子的催化作用或特异性来进行检测，具有仪器体积小、便于携带；响应灵敏、快速；选择性高、一般不需要对样品进行预处理等优点，对于用于有机磷农药的生物传感检测技术，最重要的生物敏感元件——酶的选择。常用于检测有机磷农药检测的酶类为动物酯酶和植物酯酶。但动物酯酶常常表现为保持期短，需冷冻低温保存，这个缺点非常不适合现场快速检测。而植物酯酶的优点恰恰是酶源易得，提取和保存较为方便，且酶源丰富，只需以一定比例的盐溶液或缓冲液混合提取，之后离心获得的上清液即可作为酯酶粗酶液用于检测。

本发明制备的小麦酯酶生物传感器，具有贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便、成本低廉等一系列优点。可应用于食品中有机磷农药的快速检测。

发明内容

为了解决现有酶生物传感器仪器庞大，设备昂贵，手续复杂，需专业人员进行操作，因此不适于经常性的现场检测等的问题，本发明提供了一种小麦酯酶生物传感器的制备方法，能有效提高食品中有机磷农药残留测定的速度和精度，降低生物传感器的成本。本发明中一种小麦酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于小麦酯酶生物传感器的制备方法的步骤如下：一、小麦酯酶的提取：1、小麦经粉碎过40目筛后，准确称量各10.0g，置于100mL锥形瓶中，分别加入蒸馏水，一定浓度的盐溶液各30mL，摇床中震荡提取，之后在4000r/min的速度离心20min，上清液过滤后测酶活，选择出最佳提取溶剂。二、纯化：1、脱盐将硫酸铵分级盐析后，Tris-Hcl(0.07mol/l，pH＝8)溶解的酶液装入透析袋中，对蒸馏水透析48h，并用BaCl₂溶液检测透析袋外溶液，直至透析袋外溶液与BaCl₂溶液无沉淀生成。2、使用SephadexG-100凝胶层析柱(2.5cm×60cm)，洗脱液为缓冲液，以一定的流速每管5ml进行收集，测定每管酶液比活力，检测时做三个平行样。三、小麦酯酶固定化：将去离子水与一定量的硅酸酯类化合物按照一定比例混合(R值)，加入25μLHCl，120mL甘油溶液(75％)和400mL聚乙烯醇(PVA)溶液(5％)，超声30min。之后吸取80μL溶胶，加入150μL一定浓度的TritonX-100和162μL一定浓度的PEG-400溶液，漩涡振荡20min即得到溶胶。将小麦酯酶以30mL/g的比例溶解于一定pH值的缓冲溶液中，磁力搅拌一定时间。吸取酶液加入到杂化溶胶中，旋涡振荡10min。吸取100μL的混合溶胶均匀涂布于载玻片上，于4℃干燥36h，即得到固定化后的小麦酯酶。使用前，将其在pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液中浸泡10min，再用O型圈将该酶膜固定在球型精密型酸度计玻璃电极表面，即制成小麦酯酶生物传感器。

本发明中，在小麦酯酶固定化方法中，采用壳聚糖吸附-交联法固定化小麦酯酶，克服了游离小麦酯酶稳定性差、易失活、小麦酯酶催化反应后与反应体系混在一起，无法回收和重复利用、生产成本偏高等缺点。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用。所制备的小麦酯酶生物传感器，具有贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便、成本低廉等一系列优点。可应用于食品中有机磷农药的快速检测。

具体实施方式