[发明专利]一种用于升高血小板的融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种血小板生成素模拟肽(TMP)及胰岛素样生长因子IGF-I的融合蛋白工程菌的构建以及融合蛋白的制备。

背景技术：

原发或继发性造血功能障碍，尤其是严重血小板减少发生多、危害重、治疗难度大，如何促进血小板数量和功能恢复是造血重建领域研究的热点和难点之一。血小板生成素(TPO)是巨核细胞增殖、成熟和血小板产生的主要调节因子，并且在成熟血小板生成中，TPO的作用强于目前已知的几种相关造血因子。它通过与其受体c-Mp1结合而刺激巨核细胞增殖与分化，并促进血小板的生成和释放，控制循环血中血小板的数量和功能。然而作为一个含300多个氨基酸残基的蛋白质，它也存在着免疫原性强、制备成本高、不能口服以及引起副作用等方面的不足。

1997年美国的Steven等报道利用噬菌体肽库筛选到一种与TPO无序列同源性而具有与其相似功能的模拟肽。体外实验显示这段由14个氨基酸构成的短肽与c-Mp1受体有很高的亲和力，具有刺激rhTPO依赖性细胞株Ba/F3/c-mp1的增殖功能。但由于血小板生成素模拟肽(TMP)是14个氨基酸的短肽，在体内不稳定，极容易降解，而且不容易用基因工程的方式制备。

与现有的技术相比较，本发明所提供的融合蛋白其优势在于，融合蛋白中的IGF-I是一种从血清中发现的具有促进多种细胞生长功能的活性多肽，由70个氨基酸残基组成的单一肽链生长因子组成，其一级结构与胰岛素有很高的同源性，属于同一基因家庭，并且在体内体外都具有部分胰岛素的代谢调节功能。经研究表明，IGF是动物生长的直接调节物，能够刺激多种细胞的增殖与分化，促进蛋白质的合成和结缔组织及骨髓的产生。而且IGF-I还能与一些生长因子合用，可促进相应细胞的分化成熟，例如，IGF-I与红细胞生成素合用，能刺激红细胞的成熟；与单核粒细胞集落刺激因子合用能刺激粒细胞的生成与成熟。IGF-I刺激RNA，DNA的合成和细胞增殖，特别是对细胞的有丝分裂具有重大意义，其对骨.肌肉、脂肪组织、肝、肾、脑，的生长都有重要作用。

由于IGF-I具有广谱的促进细胞生长的作用，因此将IGF-I与TMP融合，可通过与TMP受体c-Mp1结合而刺激巨核细胞增殖与分化，并促进血小板的生成和释放，加强TMP促进血小板生成作用。本发明所提供的融合蛋白分子量小，利用生物技术方法生产成本低，稳定性高，可以通过静脉、皮下、肌肉、腹腔注射等途径给药，与天然TPO比较，具有更好的升血小板的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种融合蛋白，它由TMP及胰岛素样生长因子IGF-I组成。

本发明的融合蛋白其主体部分包括两部分，其中TMP的氨基酸具有SEQID NO：1序列；胰岛素样生长因子IGF-I多肽区具有SEQ ID NO：2序列。

为了使融合蛋白的两个主体部分保持各自的完整结构，所述的TMP与胰岛素样生长因子IGF-I多肽区之间用连接肽进行连接，优选的所述的连接肽由0-10个氨基酸残基组成，更优选0-5个氨基酸残基组成，实施例中是由Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 5个氨基酸残基组成的短肽。

本发明的融合蛋白具有5种形式，融合蛋白各形式的DNA序列分别为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：7序列，DNA序列显示各种形式的融合蛋白中TMP与IGF-I多肽区之间DNA序列使用的是GGT TCT GGC TCT GGC，本领域技术人员可以选用其他形式的连接肽DNA序列。

本发明的另一目的是提供携带本发明融合蛋白DNA序列的重组表达载体。

本发明的融合蛋白是利用基因重组技术制造的。

本发明的融合蛋白根据氨基酸序列，利用氨基酸密码子的简并性特点，依据不同表达宿主，包括大肠杆菌、酵母、CHO细胞等多种表达宿主的密码子偏嗜性，本领域人员可以编码不同的核苷酸序列，使其在不同宿主内高效表达。本发明所设计的核苷酸序列可以化学合成，也可以采用PCR方法获得。选择在大肠杆菌内高效表达的pET系列表达载体，在酵母里表达的pPIC9k表达载体、在CHO细胞内表达的pcDNA3.1表达载体。

在大肠杆菌内pET3a+最适合该融合蛋白的表达、且纯化方法也比较简单，不会存在标签难以去除的问题。将其构建到表达载体pET3a+上，使其在大肠杆菌内高效表达。其存在形式为包涵体，制备方法为：培养工程菌，离心收集菌体，破菌，收集包涵体，包涵体经洗涤、变性、复性后，分别使用阳离子层析介质和阴离子层析介质进行纯化，获得纯度为95％以上的样品。