[发明专利]莲藕中儿茶素类小分子的提取方法及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及莲藕中儿茶素类小分子的提取方法和应用。 

背景技术：

医学研究表明活性氧与很多衰老相关疾病都有联系，包括肿瘤、糖尿病、动脉硬化症、癌症、哮喘、心肌缺血再灌注、早老性痴呆症、关节炎、白内障、皮炎、视网膜损伤以及肝脏损伤等，同时活性氧还可以诱导细胞的凋亡。近几年研究表明氧化损伤与病毒引起的疾病如AIDS有着密切的关系。 

人们日常食用的蔬菜中含有很多抗氧化物质。如：茄子、苔菜、尖椒、西红柿等对DPPH自由基的抑制率较高；香椿、芦蒿、莴笋叶、水芹、茼蒿、藕等具有较强的抗氧化活性，并且其抗氧化能力与其中总酚含量密切相关。 

莲(Nulumbo nuciferra Gaertn)又名芙蓉、荷、水芝、玉环、六月春等，在我国各地均有种植，以其肥嫩根状茎供食用，是千百年来及其重要的水生蔬菜，也是人们喜爱的健康蔬菜之一。目前国内外对莲的抗氧化、抗病毒等药理作用的研究主要集中在莲子、荷叶、藕节等，而对人们日常食用最多的莲藕的抗氧化研究相对较少。传统的有机溶剂萃取莲藕中总酚的方法未能明确指出其抗氧化成分的结构，并且由于有机溶剂毒性的残留，为药物及保健食品的开发带来了困难。水-乙醇体系提取莲藕中儿茶素类小分子的工艺方法及提取物生物活性的研究尚未见报道。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种无毒的水-乙醇提取莲藕中儿茶素类小分子的方法及其在医药领域中的应用。提取到的活性成分经鉴定为儿茶素和没食子儿茶素，它们都具有天然的高效抗氧化、抗HIV-1逆转录酶的活性，可制成药品或保健食品用于疾病治疗以及提高机体免疫力。莲藕是极为常见的蔬菜，在我国种植广泛，资源丰富，提取方便，无毒安全，广为人们所接受。 

本发明莲藕中儿茶素类小分子的提取方法，该小分子活性成分通过水浸提、大孔树脂吸附、葡聚糖凝胶过滤，得到两种纯化产物没食子儿茶素和儿茶素。 

莲藕中儿茶素类小分子的提取方法，经过下述步骤： 

(1)取新鲜莲藕，粉碎，去离子水4℃浸泡过夜，过滤除去残渣，5000rpm离心10min取上清旋转蒸发去多余的水分，-45℃冷冻干燥得到粗提物L； 

(2)将粗提物L溶于去离子水中，上样于大孔吸附树脂，洗脱，先用去离子水洗去杂质L1，再用30％的乙醇洗脱得到有效成分样品L2，柱子用90％乙醇洗去杂质L3； 

(3)得到的样品L2冷冻干燥后称、取上样于1.2×80cm的葡聚糖凝胶柱LH-20，洗脱，先用 去离子水和乙醇依次洗去杂质L2a~L2d，再用乙醇洗脱，通过测量OD₂₈₀得到三个洗脱峰，分别命名为L2e、L2f和L2g，收集第二个峰，为抗氧化活性总产物L2f； 

(4)L2f冷冻干燥后用制备型HPLC的C18柱，以水和甲醇混合液洗脱，洗脱速度为3ml/min，洗去杂质L2f-1后，收集得到两个抗氧化活性纯品峰，命名为L2f-2，鉴定为没食子儿茶素，以及L2f-3，鉴定为儿茶素。 

所述的步骤(1)中为冷水浸提。 

所述的步骤(2)中使用1.5×35cm的弱极性大孔吸附树脂NKA柱，仅用水和30％乙醇即可从粗提物L中一步分离出活性总产物L2。 

所述的步骤(3)中使用1.2×80cm的葡聚糖凝胶柱LH-20，仅用水和不同浓度乙醇即可对活性总产物进行用分离，用60％的乙醇有效纯化得到儿茶素类有效成分L2f。 

所述的步骤(4)中，仅用水和甲醇即可在C18反向柱上用HPLC法纯化出单一活性成分，甲醇与水的体积比例为3∶7。 

所述的提取物L2f-2和L2f-3，可应用于体内外抗氧化以及抗病毒药物或保健品。本发明提取方法的具体步骤： 

1、取新鲜莲藕，粉碎，去离子水4℃浸泡过夜，过滤除去残渣。5000rpm离心10min取上清旋转蒸发去多余的水分，-45℃冷冻干燥得到粗提物L； 

2、粗提物L，溶于去离子水中，上样于1.5×35cm的弱极性大孔吸附树脂NKA柱，洗脱，先用去离子水洗去杂质L1，再用乙醇洗脱得到样品L2，柱子再用90％乙醇洗去杂质L3(附图1)，再用去离子水冲洗再生，可连续使用； 

3、得到的样品L2冷冻干燥后上样于1.2×80cm的葡聚糖凝胶柱LH-20，洗脱速度为3ml/15min，先用去离子水和30％乙醇依次洗去杂质L2a~L2d，再用60％乙醇洗脱得到L2e、L2f和L2g，收集抗氧化活性总产物L2f(附图2)；柱子用依次用50％丙酮和去离子水再生可连续使用；