[发明专利]一种检测海水中病原菌污染的寡核苷酸微阵列技术

说明书

技术领域

本发明属于海水污染监测领域，主要内容是一种寡核苷酸微阵列技术，能够高通量地监测海水中病原细菌污染情况。能够同时检测多种致病细菌，包括河流弧菌，副溶血弧菌，溶藻弧菌，霍乱弧菌，拟态弧菌，弗尼斯弧菌，哈维弧菌，创伤弧菌，粪肠球菌，李斯特菌，铜绿假单胞菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，产气荚膜梭菌。并且这种微阵列技术能够不通过富集培养，直接从海水中检测多种指标菌，包括不能被人工培养的细菌，而不受季节的影响。除了能够评估相应海域的病原菌的污染程度，还能指示该海域是否受到生活废水污染等。

背景技术

海洋的病原菌污染和其他污染相比，比较隐蔽，但是却直接威胁到沿岸居民的健康。并且海水病原菌污染的致病细菌种类的分布特点能够直接反映海水受到生活污水、城市污水的污染情况。检测海水中致病细菌的分布状况具有多重意义。

海水中污染病原菌种类多样，陆地上的一些致病细菌经过地表径流最终汇入海水中，因此各种能够导致人类疾病的病原菌都有可能在海水中存在。此外海水中本身自然生存有丰富的病原菌，其中许多病原菌能够感染人类。这些特点要求海洋病原菌的监测提供尽可能全面和有代表性的检测信息。

DNA微阵列检测技术能同时检测多个病原菌指标，并且可以按照需求对检测信息进行细化。这一优点正好满足海水致病菌污染监测的要求。此外，DNA微阵列技术在DNA分子水平检测，还具有反应灵敏，操作简单，耗时短，准确性高，易于推广等特点。由于使用过滤富集，因此不需培养增菌。该技术还能检出不能人工培养的苛刻性菌和死菌，大大提高阳性率。鉴于这些优点，DNA微阵列技术能够作为开发海水病原菌检测的良好技术平台。

目前，全面检测海水中的污染病原菌的报道不多，大多数只能够检测有限的少数种病原菌。比如多重PCR技术。但是检测两三种菌病不能有效地给出海水病原菌的整体污染状况。并且多数已报道的海水检测技术并不是以评估海水污染状况为目的。而DNA微阵列技术能够很好地克服这些缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种综合监测海水中多种病原菌及污染指标菌的寡核苷酸微阵列技术。该微阵列技术以16S-23S rRNA基因转录间区序列作为检测靶点，通过一次聚合酶链式反应扩增，并同时获得地高辛标记，然后进行寡核苷酸杂交；通过酶标抗体催化底物显色，判读获得监测结果。检测信息丰富详尽，具有高通量的特点。并且检测不需要通过目标菌培养富集，能够在较短的时间内快速得到检测结果。本发明是通过以下技术方案实现的：一种检测海水中病原菌污染的寡核苷酸微阵列技术的43条探针序列如下：

本发明中寡核苷酸微阵列技术使用方法如下：

(1)寡核苷酸微阵列制作：

1)制备探针稀释液：1×鲑鱼精DNA溶液(1g/L)

2)制备探针溶液：用探针稀释液配置成0.1ug/μL探针溶液

3)把探针溶液点于5cm×5cm尼龙膜基质上，80℃保温2小时。

探针点样顺序如下表：