[发明专利]杀灭线虫菌制剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及环境生物技术领域，具体涉及一种杀灭土壤线虫菌制剂及其制备方法。

背景技术

土壤线虫显著增多，植物病害的种类和范围不断增加，这都是土壤生态系统遭到破坏的明证。其中土壤线虫是直接影响农作物产量的土壤害虫，尤其是种植花生、红薯的土壤，线虫可以把整块整块土地的花生、红薯吃光或破坏，几乎绝收。以前只是寻求化学杀虫剂，如涕灭威(Aldicarb)，第一年有效，第二年则几乎无效，而且它所造成的土壤污染几十年都消除不掉。所以，研究开发微生物制剂杀灭线虫势在必行。国内外已有一些研究，但是，还未见高密度、高活性，可大面积使用的菌制剂的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种高密度、高活性的杀灭土壤线虫菌制剂及其制备方法。

本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：

本发明杀灭线虫的菌制剂由巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和细黄链霉菌(Staestomyces microflavus)优化组合组成的复合菌群，其中各菌菌落数比例是1∶0.5～1∶1～1.5，吸附载体为腐殖酸。

本发明的杀灭线虫的菌制剂的制备方法，包括下述步骤：

1)将保存的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)和细黄链霉菌(Staestomyces microflavus)斜面菌种活化，分别摇瓶培养；基本培养基：可溶性淀粉培养基培养，具体配方如下：可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，NaC1 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，FeSO₄ 0.01g，蒸镏水1000mL，pH7.0～7.2，0.1Mpa，121℃高压灭菌20～30min；28～30℃培养12～24h；

2)将各菌群混合，二级液体扩大培养，总体积5～20L，以玉米面代替可溶性淀粉培养基中的可溶性淀粉，并添加重量百分比0.1％的腐殖酸，其他成分和比例与可溶性培养基相同，接种量体积百分比为5％～10％，28～30℃培养12～24h；菌群密度为5×10⁸/mL-8×10⁸/mL；

3)再三级液体扩大培养，总体积10倍于2)，扩大培养基同2)，接种量体积百分比为5％～10％，28～30℃培养12～24h；菌群密度为1×10⁹/mL-9×10⁹/mL；

4)以腐殖酸为载体将混合菌群均匀吸附、固定化于腐殖酸上，腐殖酸与的步骤3)的扩大培养液重量比为3~5，菌群密度为2×10⁸/mL-3×10⁹/mL。

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)，都是能产生几丁质酶和脱氢酶的菌，能够破坏线虫的肠壁，从而杀灭线虫；而且这三种菌都有可以促进植物根生长、改善根围生态环境的作用。将三种菌活化经三级液体扩大培养并吸附、固定化于腐殖酸上制备成菌制剂。三株菌种均购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

杀灭土壤线虫菌制剂是上述三种菌群优化组合的复合微生物，这三种菌都是农业部允许使用的安全、无害的菌。

本发明的有益效果

1)复合菌固定化于腐殖酸上，使每克复合菌制剂的有效菌菌落数(CFU)可高达10个亿以上(2~3×10⁹/g)，几乎达到了最大可能数，至今还未见如此高含菌量菌制剂的报道。腐殖酸不仅能为所培养菌提供一些营养成分，还由于其网状结构，具有较大的比表面积，所以能在单位体积内附着吸附固定化较多的菌体。所以，有效菌一旦施入土壤可以很快形成优势菌群，发挥杀灭线虫的作用，杀灭率94-98％。

2)土壤线虫的肠壁细胞含有较多的几丁质，而巨大芽孢杆菌等菌能分泌较多的几丁质酶。所以，土壤线虫一旦遇到巨大芽孢杆菌等菌体，由于其肠壁遭到几丁质酶的破坏，最后破肠而死。巨大芽孢杆菌还具有把土壤固定化的磷转化为可溶性磷，可溶性磷是植物可利用的磷。

细黄链霉菌，能产生抗生素抗病、驱虫，分泌刺激素，促进植物生长，转化矿物质。